En mus Fetal Skin Modell av scarless sårläkning

Summary

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Abstract

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Introduction

Fostrets hud sår läker snabbt och scarlessly förrän sent i dräktigheten ^1. Fostrets scarless sårläkning präglas av förnyelse av normal vävnad arkitektur och funktion. Övergången från ett scarless till ärrbildning fenotyp sker i den tredje trimestern av graviditeten hos människor och kring embryonala dag 18 (E18) i möss ^2,3. I jämförelse med vuxna, är foster sårläkning kännetecknas av snabb epithelialization, bindväv nedfall, och fibroblast migration.

Många studier har erbjudit möjliga förklaringar till fenomenet scarless sårläkning under tidig fosterutveckling. Inflammation är en grundläggande komponent i vuxen sårläkning; dock fetala sår kännetecknas av en brist på akut inflammation ^4. Huruvida detta är en konsekvens av den funktionella omognad av immunsystemet under fosterstadier förblir oklart. En färsk studie antydde att skillnader i överflöd, mattaurity och funktion av mastceller i E15 vs E18 fostrets hud kan vara ansvarig för övergången från ett scarless fenotyp, åtminstone i mus ^3. Andra studier posit att skillnader i egenskaper och överflöd av foster och vuxna lindade makrofager är ansvariga för reformering av normala extracellulära matrix (ECM) under foster sårläkning ^5.

Skillnader i miljöfaktorer under fetal och vuxen utveckling kan också påverka sårläkning. Longaker och kollegor visade att sårvätska från fostret besitter höga nivåer av hyaluronsyra-stimulerande aktivitet jämfört med ingen i vuxen sårvätska ^6. Följaktligen kan högre nivåer av hyaluronsyra, en glykosaminoglykan som främjar en mikromiljö som gynnar cellmotilitet och proliferation, i foster sårmiljö vara ansvarig för ärrlösa fenotypen sett under tidig fosterutveckling. Andra bevislinjer pekar på det faktum att fetaostl sårmiljö är relativt hypoxemisk och nedsänkt i steril fostervatten rik på tillväxtfaktorer ^7. Dock har inget definitivt svar lämnats för en kritisk händelse eller faktor under embryogenes som utlöser övergången från scarless förnyelse till fibrotisk reparation.

Förstå mekanismerna ansvariga för scarless läkning hos fostret kräver en exakt och reproducerbar modell. Här har vi detalj en reproducerbar modell för foster scarless sårläkning i ryggen E16.5 (scarless) och embryon E18.5 (ärrbildning) mus. Dessutom kan mindre variationer av denna modell användas för att utföra ett antal ytterligare studier, såsom genuttrycksanalys av fetala sår och hud ^8,9. Med tanke på att just tidsinställda graviditeter är avgörande för en framgångsrik rekapitulation av denna foster scarless sårläkning modell, vi också detalj våra protokoll för superovulation tids graviditeter.

Protocol

OBS: Alla förfaranden som beskrivs i detta dokument utförs enligt riktlinjer som fastställts av Stanford Administrativ panel för försöksdjurs Care (APLAC). 1. Timed Graviditeter – Superovulation Technique (Figur 1) OBS: Just timing graviditetslängd av musembryon för fosterkirurgi vid E16.5 och E18.5 är av avgörande betydelse. I detta avsnitt detalj vi våra protokoll för timing mus graviditeter med hjälp gravida ston serum (PMS) och humant koriongonadot…

Representative Results

För histologisk analys bör kutana sår i rygghuden för E16.5 och E18.5 musembryon skördas 48 timmar efter sårskada, fixerades i 4% PFA och paraffininbäddade. I fluorescerande transgena modeller, kan frysförvaring med oktober vara lämplig. Det finns flera fläckar som kan användas för att visualisera cellulära och bindväv arkitektur. Hematoxylin och eosin är en tvåfärgad fläck som färgar kärnor blå och eosinofila strukturer (dvs.., Cytoplasma och extracellulärt kollagen) olika nyanser av röt…

Discussion

Den kirurgiska protokollet presenteras här beskriver en excisional modell av foster murina scarless healing först publicerades 2006 av vårt laboratorium ^10. Förutom de övriga etablerade modeller av excisional såra ^11, incisional modeller av foster murina scarless healing existerar samt ^12,13. Undersökningar av foster scarless sårläkning i apa, lamm, kanin, opossum och råtta har rapporterats ^14-17. Men möss utgör en idealisk modell för att utforska foster scarless …

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
7-O MONOSOF Suture	eSuture	SN-1647G
Surgical Forceps	Kent Scientific	INS650916
Micro-scissors	Kent Scientific	INS600127
Autoclip 9mm	Texas Scientific Instruments	205060
Insulin Syringe	Thermo Fisher Scientific	22-272-382
Black Pigment	AIMS	242
BD Safety-Lok 3ml Syringe	BD Biosciences	309596
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-049
OPMI-MD Surgical Microscope	Carl Zeiss Surgical Inc
Pregnant Mares Serum (PMS)	Millipore	367222
Human Chorionic Gonadotropin (HCG)	Sigma-Aldrich	CG10
Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415
Nair (depilatory cream)	Church and Dwight Co.	22600267058