Прямая индукция человеческих нервных стволовых клеток из периферической крови гемопоэтических клеток-предшественников
Summary
Способ был разработан, чтобы непосредственно получить человека нервные стволовые клетки из гемопоэтических клеток-предшественников, обогащенных из клеток периферической крови.
Abstract
Человек по конкретным заболеваниям нейронные культуры имеют важное значение для создания в моделях пробирке для неврологических заболеваний человека. Тем не менее, отсутствие доступа к первичной человеческой взрослых нейронных культур вызывает уникальные проблемы. Последние события в индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) обеспечивает альтернативный подход для получения нейронных культур из фибробластов кожи через пациента конкретной IPSC, но этот процесс является трудоемким, требует специальных знаний и большого количества ресурсов, и может занять несколько месяцев. Это препятствует широкому применению этой технологии для изучения неврологических заболеваний. Для преодоления некоторых из этих вопросов, мы разработали метод для получения нервные стволовые клетки непосредственно из человеческого взрослых периферической крови, минуя процесс выведения IPSC. Гемопоэтических клеток-предшественников, обогащенные от взрослого человека периферической крови культивировали в пробирке и трансфицировали вирусных векторов, содержащих Сендай факторы транскрипции Sox2, октябрь3/4, Klf4 и C-Myc. Результаты трансфекции в морфологических изменений в клетках, которые в дальнейшем выбранных с помощью человека среда нейронной предшественников, содержащий основной фактор роста фибробластов (bFGF) и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF). Полученные клетки характеризуются выражения для нейронных маркеров стволовых клеток, таких как нестина и SOX2. Эти нервные стволовые клетки могут быть в дальнейшем дифференцирована с нейронами, астроглию и олигодендроциты в указанной среде для дифференцировки. Использование легко доступных образцов периферической крови человека, этот способ может быть использован для получения нервные стволовые клетки для дальнейшей дифференциации нервных клеток к для моделирования в пробирке неврологических расстройств и может продвинуть исследования, связанные с патогенезе и лечении этих заболеваний.
Introduction
В пробирке нейронов культуры были использованы в качестве основополагающего инструмента исследований неврологических заболеваний. Первичный животных (в основном грызунов) нейронные культуры 1, 2 и нейронные клеточные линии человека, полученные из глиомы или других опухолей наиболее часто используемый в таких исследованиях. Тем не менее, было признано, что существуют значительные различия между грызунов и клетках человека. Многие выводы, основанные на грызунах не могут быть переведены на людей. Кроме того, с быстрым развитием анализа массы геномной информации и относительно легко редактировать генов и весь секвенирование генома, тенденция становится все более и более ориентированы на обнаружение заболевания, склонные гены и разграничения их функций и роли в конкретных заболеваний, что делает несколько человеческих нейронов клеточные линии ограничивается только использованием. Теоретически, первичные нервные культуры человека, полученные из образцов пациентов нервной системы лучший выбор, но их невозможно получить; следовательно, альтернатива метОРВ необходимо. В последние годы некоторые подходы были использованы, с двумя является наиболее различимы. После развития техники генерации индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с помощью мыши и соматических клеток человека 3, 4, нервные клетки могут быть дополнительно отличается от них 5-7. Тем не менее, генерации и характеризующие IPSC требует интенсивного труда, методы и ввод времени, иногда даже чрезмерно. Вскоре после этого, еще один подход был разработан, чтобы преобразовать непосредственно нервных клеток из соматических клеток 8, 9. Как в результате нейроны непролиферативная, он ограничивает его применение в интенсивных исследований и скрининга лекарственных средств, что требует большого количества клеток. Для того, чтобы преимущества обеих технологий, прямой вывод нервных стволовых клеток / клеток-предшественников из соматических клеток были изучены несколько групп 10-12, который обходит утомительный процесс генерации IPSC и характеристике, но еще предоставледе приличное число нервных стволовых клеток для последующего нервной дифференциации. Ранее мы показали, что после введения транскрипционных факторов Яманака в гемопоэтических клеток-предшественников, нервные стволовые клетки могут быть непосредственно получены с использованием нейронной клетки-предшественника, выбирающий среду 13. Здесь мы сообщаем метод в деталях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Подробный протокол, чтобы непосредственно генерировать нервные стволовые клетки из периферической гемопоэтических клеток-предшественников обеспечивается.
По сравнению с фибробластов, периферической крови человека является более доступным. Использование подарил пр…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no conflicts of interest to disclose.
Materials
| Material List | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lymphocyte Separation Medium | Lonza | 17-829E | 1 X |
| SepMate | Stemcell Technologies | 15415 | 15 mL |
| Human Serum | Invitrogen | 34005-100 | |
| Antibiotics | Gibco | 15240-062 | 1% |
| CD34 MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-056-701 | |
| EDTA | Cellgro | 46-034-Cl | 2mM |
| MACS LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| StemSpan SFEM Medium | Stemcell Technologies | 9650 | 1X |
| IMDM | Quality Biologicals | 112-035-101 | 1X |
| TPO | Peprotech | 300-18 | 100 ng/mL |
| Flt-3 | Peprotech | 300-19 | 100 ng/mL |
| SCF | Peprotech | 300-07 | 100 ng/mL |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | 20 ng/mL |
| IL-7 | Peprotech | 200-07 | 20 ng/mL |
| IPS Sendai Reprogramming Kit | Life technologies | A1378001 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| CryoTube vials | Thermo | 368632 | |
| Mr. Frosty container | Thermo | 5100-0001 | |
| DMEM/F12 | Life technologies | 12400-024 | 1X |
| N2 supplement | Life technologies | 17502-048 | 1X |
| Bovine serum albumin | Sigma | A2934 | 0.1% (w/v) |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/ml |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 supplement | Life technologies | 17504-044 | 1X |
| NSC serum free medium | Life Technologies | A1050901 | 1X |
| Poly-D-lysine/laminin coated cover slips | BD Bioscences | 354087 | |
| cAMP | Sigma | A9501 | 300 ng/ml |
| Vitamin C | Sigma | A0278 | 0.2 mM |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P4957 | 1X |
| PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | 10 ng/ml |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | 2 ng/ml |
| Shh | Peprotech | 1314-SH/CF | 2 ng/ml |
| T3 | Sigma | T6397 | 3 nM |
| PFA | Sigma | P6148 | 4% |
| PBS | Quality Biological | 119-069-101 | 1X |
| Goat serum | Sigma | G9023 | 4% |
| TritonX-100 | Sigma | T9284 | |
| Mouse monoclonal anti-Nestin | Millipore | AB5922 | 1:1000 dilution |
| Anti-SOX2 antibody | Applied Stemcell | ASA0120 | Ready to use |
| Mouse anti-βIII-tubulin antibody | Promega | G712A | 1:1000 dilution |
| Rabbit anti-GFAP antibody | Sigma | G4546 | 1:100 dilution |
| Anti-O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | IgM; 1 ng/ml |
| Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody | Life techniologies | A11012 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody | Life techniologies | A11001 | 1:400 dilution |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody | Life techniologies | A21042 | 1:250 dilution |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 ug/ml |
References
- Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941 (2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington’s Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).
- Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
- Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
- Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
- Lee, S. -. T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801 (2011).
- Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
- Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
- Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720 (2013).
- Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
- Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
- Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).
