Summary

Periferik kan Hematopoetik Progenitör Hücreleri İnsan Sinir Kök Hücre Doğrudan İndüksiyon

Published: January 28, 2015
doi:

Summary

Bir yöntem de periferik kan hücrelerinden zenginleştirilen hematopoietik projenitör hücrelerinden insan nöral kök hücrelerini elde etmek için geliştirilmiştir.

Abstract

İnsan hastalıkları spesifik nöronal kültürler insan nörolojik hastalıklar için in vitro bir model oluşturmak için gereklidir. Ancak, birincil insan yetişkin nöral kültürlere erişim eksikliği benzersiz zorluklar yükseltir. Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin son gelişmeler (iPSC) hastaya özel IPSC yoluyla deri fibroblastlar nöral kültürleri türetmek için alternatif bir yaklaşım sağlar, ancak bu süreç emek yoğundur, özel uzmanlık ve kaynakların büyük miktarda gerektirir, ve birkaç ay sürebilir. Bu nörolojik hastalıkların çalışma Bu teknolojinin geniş bir uygulama önler. Bu sorunlardan bazılarının üstesinden gelmek için, biz iPSC derivasyon işlemini atlayarak, doğrudan insan yetişkin periferal kanından sinir kök hücreleri elde etmek için bir yöntem geliştirdik. Insan yetişkin periferal kanından zenginleştirilmiş hematopötik projenitör hücrelerin in vitro olarak kültürlendi ve Ekim transkripsiyonel faktörler Sox2 içeren Sendai virüsü vektörleri ile transfekte3/4, Klf4 ve c-Myc. ayrıca, temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) içeren insan nöral projenitör ortamı kullanılarak seçilmektedir hücrelerinde morfolojik değişiklikler transfeksiyon ile sonuçlanır. Elde edilen hücreler, Nestin ve Sox2 gibi nöral kök hücre işaretçileri için ekspresyonu ile karakterize edilir. Bu nöral kök hücreler ayrıca nöronların, astroglial ve belirtilen farklılaşma medya oligodendrositlere ayırt edilebilir. Kolayca erişilebilir insan periferal kan örnekleri kullanarak, bu yöntem, nörolojik bozukluklar, in vitro model için nöral hücrelere daha fazla farklılaşması için nöral kök hücrelerini elde etmek için kullanılabilir ve bu hastalıkların patojenezinde ve tedavi ile ilgili çalışmalar ilerleyebilir.

Introduction

In vitro nöronal kültürler nörolojik hastalıkların çalışmaları için temel bir araç olarak kullanılmıştır. Birincil hayvan (çoğunlukla, kemirgen) bir sinir kültürlerinin 1, 2 ve gliom ve diğer tümörlerinden türetilmiş insan nöral hücre çizgileri, en yaygın olarak kullanılan bu tür çalışmalar bulunmaktadır. Bununla birlikte, kemirgen ve insan hücreleri arasında önemli farklılıklar olduğu kabul edilmiştir. Kemirgenler dayalı birçok bulgular insanlara tercüme edilemez. Ayrıca, kitle genomik bilgiler ve nispeten kolay gen düzenleme ve tüm genom sıralamasını analiz hızlı gelişmeler, eğilim daha dişli birkaç insan nöronal kılan, hastalık eğilimli genler keşfetmek ve belirli hastalıklarda işlevlerini ve rollerini ortaya koymayı amaçlayan bir hücre hatları, sadece kullanım sınırlıdır. Teorik olarak, hasta sinir sisteminin örneklerinden elde edilen insan primer sinir kültürleri en iyi seçimdir ama elde etmek imkansız; dolayısıyla alternatif metODS gereklidir. Son yıllarda, bazı yaklaşımlar iki en ayırt olmak, takip edilmiştir. Üretilmesi uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSC) kullanılarak fare ve insan somatik hücre tekniğin geliştirilmesi eden 3, 4, nöral hücreler, bunlardan 5-7 den daha farklı olabilir. Ancak, üreten ve IPSC karakterize yoğun emek, teknikleri, ve zaman giriş talepleri, hatta bazen engelleyici. Kısa bir süre sonra, bir başka yaklaşım doğrudan somatik hücre 8, 9 ile ilgili nöronal hücrelerini transforme etmek üzere geliştirilmiştir. Elde edilen nöronlar proliferatif olmayan olduğu için, yoğun çalışmalar ve hücre büyük miktarda gerektirir ilaç tarama, içinde bunun uygulanmasını kısıtlar. Her iki teknikler, nöral kök doğrudan türetme avantajları almak için / somatik hücrelerden progenitör hücreleri hala iPSC üretimi ve karakterizasyonu ama yazarlara sıkıcı sürecini atlar çeşitli gruplar 10-12 tarafından araştırılmaktadırdes sonra nöral farklılaşma için nöral kök hücrelerin iyi bir sayı. Biz daha önce hematopoetik progenitör hücrelerin içine Yamanaka transkripsiyon faktörlerinin giriş izleyen, nöral kök hücreler doğrudan ortamı 13 seçerek bir nöral progenitör hücre kullanılarak oluşturulan olabileceğini göstermiştir. Burada, biz detaylı yöntem rapor.

Protocol

Yetişkin Tüm Blood 1. Zenginleştirme Hematopoetik Progenitor Hücreleri Not: hematopötik projenitör hücreleri ve CD34 + hücreleri yoğunluk gradyan santrifüj göre yöntemler kullanılarak kordon kanı, lökoferez malzeme ve tam kan da dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan elde edilmiş periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC), saflaştırılabilir. Burada listelenen yöntem örnek olarak tam kan kullanır. Tüm kandan PBMC izole edilmesi: Ekin merkezi del…

Representative Results

CD34 hücrelerinin kalitesi nöral kök hücre naklinin başarısı için kritik öneme sahiptir. Yüksek kaliteli CD34 hücreleri kültür ilk birkaç gün boyunca çoğalırlar ve sadece kültür damarları (Şekil 1A) alt üzerinde yüzen, sigara yapışık, homojen yuvarlak hücreler olarak görünür. Hücre genişletmek spesifik olmayan hücre agrega hücre kültürü sırasında oluşabilecek ise, zaman (Şekil 1B) üzerinden genişletir agrega, ve dernek başarılı enfeks…

Discussion

Doğrudan periferik hematopoetik progenitör hücrelerden sinir kök hücreleri üretmek için detaylı bir protokol sağlanır.

Fibroblast hücreleri ile karşılaştırıldığında, insan periferal kan daha erişilebilir. Sunulan protokol fazla 1 x 10 5 hematopoietik progenitör hücreler veya CD34 pozitif hücreleri kullanarak, tam kan, 10 ml zenginleştirilebilir. LuM trombosit toplayıcı U kirlenme genellikle önlenebilir olmasa da, kolayca düşük hızlı santrifüj ile a…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Materials

Material List
Name Company Catalog Number Comments
Lymphocyte Separation Medium Lonza 17-829E 1 X
SepMate Stemcell Technologies 15415 15 mL
Human Serum Invitrogen 34005-100
Antibiotics Gibco 15240-062 1%
CD34 MultiSort Kit Miltenyi Biotec 130-056-701
EDTA Cellgro 46-034-Cl  2mM
MACS LS Column Miltenyi Biotec 130-042-401
StemSpan SFEM Medium Stemcell Technologies 9650 1X
IMDM Quality Biologicals 112-035-101 1X
TPO Peprotech 300-18 100 ng/mL
Flt-3 Peprotech 300-19 100 ng/mL
SCF Peprotech 300-07 100 ng/mL
IL-6 Peprotech 200-06 20 ng/mL
IL-7  Peprotech 200-07 20 ng/mL
IPS Sendai Reprogramming Kit Life technologies A1378001
Cell scraper Sarstedt 83.183
DMSO Sigma D2650
CryoTube vials Thermo 368632
Mr. Frosty container Thermo 5100-0001
DMEM/F12 Life technologies 12400-024 1X
N2 supplement Life technologies 17502-048 1X
Bovine serum albumin Sigma A2934 0.1% (w/v)
bFGF Peprotech 100-18B 20 ng/ml
EGF Peprotech AF-100-15
B27 supplement Life technologies 17504-044 1X
NSC serum free medium Life Technologies A1050901 1X
Poly-D-lysine/laminin coated cover slips BD Bioscences 354087
cAMP Sigma A9501 300 ng/ml
Vitamin C Sigma A0278 0.2 mM
BDNF Peprotech 450-02 10 ng/ml
GDNF Peprotech 450-10 10 ng/ml
Poly-L-Ornithine Sigma P4957 1X
PDGF-AA Peprotech 100-13A 10 ng/ml
NT-3 Peprotech 450-03 2 ng/ml
Shh Peprotech 1314-SH/CF 2 ng/ml
T3 Sigma T6397 3 nM
PFA Sigma P6148 4%
PBS Quality Biological 119-069-101 1X
Goat serum Sigma G9023 4%
TritonX-100 Sigma T9284
Mouse monoclonal anti-Nestin Millipore AB5922 1:1000 dilution
Anti-SOX2  antibody Applied Stemcell ASA0120 Ready to use
Mouse anti-βIII-tubulin antibody Promega G712A 1:1000 dilution
Rabbit anti-GFAP antibody Sigma G4546 1:100 dilution
Anti-O4 antibody R&D Systems MAB1326 IgM; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit antibody Life techniologies A11012 1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse antibody Life techniologies A11001 1:400 dilution
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgM antibody Life techniologies A21042 1:250 dilution
DAPI Sigma D9542 1 ug/ml

References

  1. Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941 (2011).
  2. Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neuroblast assay: an assay for the generation and enrichment of neuronal progenitor cells from differentiating neural stem cell progeny using flow cytometry. J Vis Exp. (62), (2012).
  3. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  4. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  5. Zhang, N., An, M. C., Montoro, D., Ellerby, L. M. Characterization of Human Huntington’s Disease Cell Model from Induced Pluripotent Stem Cells. PLoSCurr. 2, RRN1193 (2010).
  6. Park, I. H., et al. Disease-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  7. Song, B., et al. Neural differentiation of patient specific iPS cells as a novel approach to study the pathophysiology of multiple sclerosis. Stem Cell Research. 8 (2), 259-273 (2012).
  8. Vierbuchen, T., et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature. 463 (7284), 1035-1041 (2010).
  9. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 10343-10348 (2011).
  10. Lee, S. -. T., et al. Direct Generation of Neurosphere-Like Cells from Human Dermal Fibroblasts. PLoS ONE. 6, e21801 (2011).
  11. Thier, M., et al. Direct Conversion of Fibroblasts into Stably Expandable Neural Stem Cells. Cell Stem Cell. 10 (4), 473-479 (2012).
  12. Lujan, E., Chanda, S., Ahlenius, H., Südhof, T. C., Wernig, M. Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 2527-2532 (2012).
  13. Wang, T., et al. Derivation of neural stem cells from human adult peripheral CD34+ cells for an autologous model of neuroinflammation. PLoS ONE. 8, e81720 (2013).
  14. Jin, C. H., et al. Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells. Gene Ther. 10 (3), 272-277 (2003).
  15. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 14234-14239 (2011).
  16. Goolsby, J., et al. Hematopoietic progenitors express neural genes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 14926-14931 (2003).

Play Video

Cite This Article
Wang, T., Choi, E., Monaco, M. C. G., Major, E. O., Medynets, M., Nath, A. Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (95), e52298, doi:10.3791/52298 (2015).

View Video