Всего горе Маркировка ресничек в Главном обонятельной системе мышей
Summary
Cilia of olfactory sensory neurons contain proteins of the signal transduction cascade, but a detailed spatial analysis of their distribution is difficult in cryosections. We describe here an optimized approach for whole mount labeling and en face visualization of ciliary proteins.
Abstract
The mouse olfactory system comprises 6-10 million olfactory sensory neurons in the epithelium lining the nasal cavity. Olfactory neurons extend a single dendrite to the surface of the epithelium, ending in a structure called dendritic knob. Cilia emanate from this knob into the mucus covering the epithelial surface. The proteins of the olfactory signal transduction cascade are mainly localized in the ciliary membrane, being in direct contact with volatile substances in the environment. For a detailed understanding of olfactory signal transduction, one important aspect is the exact morphological analysis of signaling protein distribution. Using light microscopical approaches in conventional cryosections, protein localization in olfactory cilia is difficult to determine due to the density of ciliary structures. To overcome this problem, we optimized an approach for whole mount labeling of cilia, leading to improved visualization of their morphology and the distribution of signaling proteins. We demonstrate the power of this approach by comparing whole mount and conventional cryosection labeling of Kirrel2. This axon-guidance adhesion molecule is known to localize in a subset of sensory neurons and their axons in an activity-dependent manner. Whole mount cilia labeling revealed an additional and novel picture of the localization of this protein.
Introduction
Мышь обонятельный эпителий в полости носа состоит из 6-10 млн биполярных обонятельных сенсорных нейронов 1. Каждый обонятельный нейрон выбирает один из 1200 одоранта рецепторных генов для экспрессии. Обнаружение пахучих веществ начинается с одоранта связывания обонятельного рецептора 2, который затем активирует АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ типа III (ACIII) 3 с помощью обоняния специфического белка G Gα олф 4. В результате рост циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) открывает циклических нуклеотидов закрытого (CNG), неселективный катион канал, ведущий к притоку Ca 2+ и Na +, а впоследствии Ca 2+ приток приводит к открытию Са 2+ активированного Cl – канал 5,6. Полученный наружу Cl – поток способствует высокой внутриклеточной Cl – концентрация поддерживается устойчивый Cl – поглощение, вероятно, через Na + / K + / Cl – котранспортера NKCC1,Cl – / HCO 3 – теплообменник SLC4A1, и, возможно, дополнительные еще не определены перевозчики 6-8.
Биполярные обонятельные нейроны имеют одно-, неразветвленные аксоны, которые выступают непосредственно к обонятельной луковице, и дендриты, который проходит к поверхности эпителия и заканчивается в качестве специализированного отделения, дендритных ручки. С этой ручкой, 10-30 ресничек, которые могут достигать в длину до 50-60 мкм, исходят в слизи, покрывающей поверхности эпителия 9. Белки канонической каскада трансдукции сигнала в основном локализованы в мембране этих ресничек. Увеличился сенсорная поверхность эпителия усиливает способность обнаруживать отдушки. Из-за плотности сенсорных нейронов, реснички, проходящую от соседних дендритных ручки смешиваются. Это смешение приводит к случайной смеси ресничек из различных нейронов, экспрессирующих различные типы обонятельные рецепторы, на поверхности эпителия. Выявление и клетокулар распределение цилиарных белков, которые присутствуют только в подгруппе сенсорных нейронов поэтому трудно в криосрезов. Кроме того, точная локализация таких белков вдоль ресничек едва возможно, поскольку, как правило, криосрезы тоньше, чем средняя длина ресничек.
Чтобы включить расследование мерцательного локализации до сих пор не охарактеризованных мембранных белков в обонятельных нейронов, мы оптимизировали собственная методика подготовки лица, которая позволяет детальный анализ локализации белка в ресничками. Вкратце, мышь умерщвляют и глава разделена рядом с линии. Раковин, носа и лобной кости удаляют, чтобы обнажить перегородки. Перегородки с обонятельной части футеровки эпителия ослаблен за счет сокращения всех соединений в полость носа. После ввода перегородки в чашку Петри, заполненную раствором Рингера, эпителий отслаивают унд передается на предметное стекло с нанесенным покрытием. После короткого fixatионная шаг, Иммуноокрашивание процедуры могут быть выполнены, если обращение является как можно более плавными, чтобы избежать повреждения хрупкого ткани. Мы демонстрируем достижимое разрешение путем сравнения окраски двух различных мембранных белков в обонятельной ресничек в классических криосрезов и в ванной подготовки лица описаны.
Protocol
Representative Results
Discussion
The en face preparation technique described in this protocol provides a powerful tool for the detailed analysis of the olfactory system. So far, most studies characterizing the localization of signaling proteins use immunostainings of cryosections. They present a good overview of the olfactory epithelium, and protein expression in distinct cell types or regions can be easily identified. However, expression in olfactory cilia is sometimes hard to detect. Even if ciliary localization is obvious, cryosections offer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (Exc257, SFB958).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Spring scissors | straight tip, multiple suppliers | ||
| Surgical scissors | sharp and blunt end, multiple suppliers | ||
| Fine forceps | curved tips, Dumont #7, multiple suppliers | ||
| Razor blade | extra thin, multiple suppliers | ||
| Binocular with illumination | multiple suppliers, Stemi 2000-C, Zeiss | ||
| Petri dish | multiple suppliers | ||
| Liquid-blocker pen | Science Services | N71310 | |
| Polysine coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
| Confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SPE | |
| primary antibody Goat anti-Kirrel2 | R&D Systems | AF2930 | 1:200 |
| primary antibody Rabbit anti-mOR-EG | Baumgart et al., 2014 | 1:200 | |
| secondary antibodies | Life Technologies | A21206, A11057 | 1:500 |
| Mounting medium, ProLong Gold antifade reagent | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 441244 | toxic, work under fume hood |
References
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65 (1), 175-187 (1991).
- Wong, S. T., et al. Disruption of the type III adenylyl cyclase gene leads to peripheral and behavioral anosmia in transgenic mice. Neuron. 27 (3), 487-497 (2000).
- Belluscio, L., Gold, G. H., Nemes, A., Axel, R. Mice deficient in G(olf) are anosmic. Neuron. 20 (1), 69-81 (1998).
- Brunet, L. J., Gold, G. H., Ngai, J. General anosmia caused by a targeted disruption of the mouse olfactory cyclic nucleotide-gated cation channel. Neuron. 17 (4), 681-693 (1996).
- Reisert, J., Lai, J., Yau, K. W., Bradley, J. Mechanism of the excitatory Cl- response in mouse olfactory receptor neurons. Neuron. 45 (4), 553-561 (2005).
- Hengl, T., et al. Molecular components of signal amplification in olfactory sensory cilia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 6052-6057 (2010).
- Smith, D. W., Thach, S., Marshall, E. L., Mendoza, M. G., Kleene, S. J. Mice lacking NKCC1 have normal olfactory sensitivity. Physiolog., & Behavior. 93 (1-2), 44-49 (2008).
- Menco, B. P. Ultrastructural aspects of olfactory signaling. Chemical Senses. 22 (3), 295-311 (1997).
- Serizawa, S., et al. A neuronal identity code for the odorant receptor-specific and activity-dependent axon sorting. Cell. 127 (5), 1057-1069 (2006).
- Baumgart, S., et al. Scaffolding by MUPP1 regulates odorant-mediated signaling in olfactory sensory neurons. Journal Of Cell Science. 127 (11), 2518-2527 (2014).
- Strotmann, J., Wanner, I., Krieger, J., Raming, K., Breer, H. Expression of odorant receptors in spatially restricted subsets of chemosensory neurones. Neuroreport. 3 (12), 1053-1056 (1992).
- Jenkins, P. M., McEwen, D. P., Martens, J. R. Olfactory cilia: linking sensory cilia function and human disease. Chemical Senses. 34 (5), 451-464 (2009).
- Tadenev, A. L., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome protein-8 (BBS8) perturbs olfactory function, protein localization, and axon targeting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (25), 10320-10325 (2011).
