In-vitro-Funktionelle Charakterisierung von Maus Colorectal Afferente Endings
Summary
This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.
Abstract
Dieses Video zeigt im Detail ein in vitro-Einzelfaser elektrophysiologische Ableitung Protokoll mit einer Maus Kolorektums-Nerven Vorbereitung. Der Ansatz ermöglicht unvoreingenommene Identifizierung und funktionelle Charakterisierung einzelner kolorektalen Afferenzen. Extrazelluläre Ableitungen von propagierten Aktionspotentiale (APs), die von einem oder wenigen afferenten stammen (dh Einzelfaser) rezeptiven Felder (RFS) in Kolorektum aus gehänselt Nervenfaser Faszikel gemacht. Die Kolorektums ist entweder mit dem Becken (PN) oder Lenden splanchnischen (LSN) Nerven befestigt und in Längsrichtung geöffnet entfernt. Das Gewebe wird in einer Aufnahmekammer gebracht, fixiert flach und mit Sauerstoff angereichertem Krebs-Lösung perfundiert. Brenn elektrischen Stimulation verwendet, um die kolorektale afferenten Endungen, die durch drei verschiedene mechanische Stimuli getestet lokalisieren (blunt Sondieren, Schleimhaut Streichen und Umfangsdehnung) funktionell zu kategorisieren Afferenzen in fünf mechanosensitive Klassen. Endings Reaktion auf keine dieser mechanische Reize werden als mechanisch unempfindlich Afferenzen (MIAs) kategorisiert. Sowohl mechanosensitive und MIAs kann Sensibilisierung (dh, verbesserte Reaktion, reduziert Schwelle und / oder Erwerb von Mechanosensitivität) bewertet werden, indem die lokale Exposition des RFs Chemikalien (zB entzündliche Suppe (IS), Capsaicin, Adenosintriphosphat (ATP)). Wir beschreiben die Geräte und Kolorektums-Nerven Aufnahme Vorbereitung, Ernte Kolorektums mit angeschlossenem PN oder LSN, die Identifizierung von RFs im Kolorektums, Einzelfaser-Aufnahme von Nervenfaszikel und lokalisierte Anwendung von Chemikalien auf die RF. Außerdem werden Probleme der Herstellung und Anwendung von standardisierten mechanischen Stimulation ebenfalls diskutiert.
Introduction
Schmerzüberempfindlichkeit sind die vorherrschenden Beschwerden von Patienten mit funktionellen gastrointestinalen Störungen einschließlich Reizdarmsyndrom (IBS), die in Abwesenheit des sichtbaren pathobiologischen Ursache oder Gewebeschäden vorliegen. Zum Beispiel weisen IBS-Patienten Überempfindlichkeit, einschließlich erhöhter Antworten auf rektale Ballon Spannungsgefühl und erhöhte Empfindlichkeit während des normalen Darmfunktion sowie Überempfindlichkeit der somatischen Weisung (dh Druckschmerz im Bauchbereich) 1. Da Targeting kolorektalen Afferenzen hat sich als wirksam bei der Linderung von Schmerzen und Überempfindlichkeit in IBS-Patienten (zB intrarektale Einträufeln von Lokalanästhetika 2,3; orale Aufnahme des Guanylatzyklase-C-Agonisten linaclotide 4-6) sein, ein besseres Verständnis der afferenten Innervation Kolorektum ist wichtig.
Visceral Afferenzen, darunter Dickdarm- AfferenzenIn der Lage sind zu reagieren, um chemische / Nähr- und thermischen Behandlungsformen (zum Beispiel 7-9). Allerdings viszerale Afferenzen Reaktion auf mechanische Reize (dh mechanosensitive Afferenzen) waren die am besten untersuchte, weil mechanische Reize (zB Lumen Blähungen, Dehnung) sind diejenigen, die in der Regel führen zu bewussten Empfindungen, einschließlich Beschwerden und Schmerzen 10-16. Darüber hinaus werden die Eingeweide auch mechanisch unempfindlich Afferenzen (MIAs) innerviert, allgemein als stille oder Schlaf Nozizeptoren 17. Unter normalen physiologischen Bedingungen, müssen MIAs nicht auf mechanische Reize reagieren und haben eine sehr hohe Ansprechschwellen 18, sondern kann aktiv werden und erwerben Mechanosensitivität in pathophysiologischen Bedingungen und dazu beitragen, Überempfindlichkeit.
Unter Verwendung der in vitro Herstellung und hier beschriebene Protokoll, entwickelt und verwendet ein elektrisches Stimulus-Strategie in See wir rch für aufnahmeEnden und ermöglicht unvoreingenommene Identifizierung der beiden mechanosensitive und MIA Enden in der Kolorektums 19. Das kolorektale Innervation aus Lenden splanchnischen (LSN) und Beckennerv (PN) Wege abgeleitet und enthält kolorektalen Afferenzen, die in fünf mechanosensitive Klassen (seröse, Schleimhäute, muskulös, Muskel-Schleimhaut, mesenterialen) und eine MIA-Klasse 20 eingestuft werden können. Mit dieser In-vitro-Vorbereitung, fanden wir, dass kolorektalen MIAs erworben Mechanosensitivität (Sensibilisierung) nach kurzzeitiger ihres rezeptiven Felder zu einer entzündlichen Suppe (IS), die 71% der MIAs in der PN-Bahn und 23% der MIAs im LSN Weg sensibilisiert 19. Wir haben auch dokumentiert Langzeitsensibilisierung (bis 28 Tage) von MIA in Zusammenhang mit langanhaltenden Verhaltens viszerale Hypersensitivität (dh in Mäusen intrakolische Behandlungen mit Zymosan 21 oder 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) 22) .
jove_content "> Unter mechanosensitive Afferenzen, muskulös und Muskel-Schleimhaut-Afferenzen sind die einzigen Klassen, die tonisch kodieren Umfangsdehnung des colorectal (dh sind Stretch-und Kleinschreibung) und dienstbar die Kodierung der schädlichen kolorektale Dehnung 23,24. Mit Hilfe eines computergesteuerten Kraftaktuator wir mit einem Standard, homogene und reproduzierbare gefahren Dehnung in der Umfangsrichtung des abgeflachten kolorektales Gewebe und weiter kategorisiert dehnungsempfindlichen Afferenzen als Niedrigschwellenwert und hohem Schwellenwert 23. Darüber hinaus den Zeitverlauf der Sensibilisierung von Dehnungs sensitive Afferenzen nach intrakolische Zymosan 21 oder TNBS 22 Behandlung entspricht der Beginn, Ausdauer, und / oder Wiederherstellung von Verhaltens viszerale Hypersensitivität, was auf eine Rolle von Dehnungsempfindlichen Dick Afferenzen in viszeralen Schmerzen und Überempfindlichkeit.Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebene in vitro-Nerven Kolorektums Vorbereitung hat sich als leistungsfähiges Konzept für neuronale Kodierung Funktionen einzelner kolorektalen Afferenzen, die schön ergänzt andere nicht-funktionale Ansätze (zB Zell-, Molekular- und histologische Untersuchungen) auf viszeralen sensorischen Neuronen (studieren siehe Bewertung 27 für Details). Neuronalen Mechanismen Beitrag zur Nozizeption und langfristig colorectal Überempfindlichkeit festgestellt worden sind und pharmak…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIH award R01 DK093525 (GFG). We greatly appreciate the scientific review and grammatical editing of the manuscript by Dr. Amber Shaffer (University of Pittsburgh) and thank Michael Burcham for assistance in preparation of figures.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Leica MZ16 stereo microscope | Leica Microsystems Inc. | ||
| Leica IC D camera | Leica Microsystems Inc. | ||
| Amplifier | World Precision instruments, Inc. | SYS-DAM80 | Low-noise differential amplifier |
| Two-compartment tissue chamber | Custom made | ||
| Power1401 | Cambridge Electronic Design Limited | Power1401 | Data acquisition, analog signal input/out |
| Spike2 v5.02 | Cambridge Electronic Design Limited | Software package that works with the Power1401 | |
| Audio monitor | Natus | Am 8 | |
| Square pulse stimulator | Natus | S48 | To deliver electrical stimuli |
| Photoelectric isolation unit | Natus | PSIU6 | Stimulus isolation to reduce noise |
| Concentric bipolar microelectrode | FHC Inc. | CBFFG75 | To deliver electrical stimuli |
| Dual-mode lever system | Aurora Scientific Inc. | Series 300C | To deliver mechanical stimuli |
| forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | forceps with fine tips |
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