माउस कोलोरेक्टल अभिवाही अंत के लिए इन विट्रो कार्यात्मक लक्षण वर्णन में
Summary
This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.
Abstract
इस वीडियो में विस्तार से एक माउस colorectum-तंत्रिका तैयारी का उपयोग कर एक में इन विट्रो एकल फाइबर electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रोटोकॉल को दर्शाता है। दृष्टिकोण निष्पक्ष पहचान और व्यक्तिगत कोलोरेक्टल afferents के कार्यात्मक लक्षण वर्णन अनुमति देता है। एक या कुछ अभिवाही से उत्पन्न होने वाले प्रचारित कार्रवाई क्षमता (ए पी एस) के बाह्य रिकॉर्डिंग (यानी, एकल फाइबर) colorectum में ग्रहणशील क्षेत्रों (RFS) छेड़ा तंत्रिका फाइबर fascicles से बने हैं। colorectum श्रोणि (पीएन) या काठ का आंत-संबंधी (LSN) तंत्रिका जुड़ी है और अनुलंबीय खोला साथ या तो हटा दिया जाता है। ऊतक फ्लैट टिकी है और ऑक्सीजन क्रेब्स समाधान के साथ perfused, एक रिकॉर्डिंग कक्ष में रखा गया है। फोकल बिजली की उत्तेजना कार्यात्मक पांच mechanosensi में afferents वर्गीकृत करने के लिए, (जांच कर रही श्लैष्मिक पथपाकर और परिधीय खिंचाव कुंद) आगे तीन अलग यांत्रिक उत्तेजनाओं से जांच की जाती है, जो कोलोरेक्टल अभिवाही अंत, पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता हैेश्य कक्षाएं। इन यांत्रिक उत्तेजनाओं से कोई भी का जवाब देने के अंत यंत्रवत्-असंवेदनशील afferents (MIAs) के रूप में वर्गीकृत किया जाता है। रसायनों के लिए RFS के स्थानीय लोगों तक पहुंचाने के द्वारा mechanosensitive और MIAs संवेदीकरण (यानी, बढ़ाया प्रतिक्रिया, कम दहलीज, और / या mechanosensitivity के अधिग्रहण) के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है, दोनों (जैसे, भड़काऊ सूप (है), capsaicin, adenosine triphosphate (एटीपी))। हम उपकरण और colorectum-तंत्रिका रिकॉर्डिंग तैयारी, संलग्न पी.एन. या LSN, तंत्रिका fascicles से colorectum, एकल फाइबर रिकॉर्डिंग में RFS की पहचान के साथ colorectum की फसल, और आरएफ के लिए रसायनों के स्थानीय आवेदन का वर्णन है। इसके अलावा, तैयारी और मानकीकृत यांत्रिक उत्तेजना के आवेदन की चुनौतियों पर भी चर्चा कर रहे हैं।
Introduction
दर्द और अतिसंवेदनशीलता स्पष्ट pathobiological कारण या ऊतकों को नुकसान के अभाव में मौजूद हैं जो चिड़चिड़ा आंत्र सिंड्रोम (IBS) सहित कार्यात्मक गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल विकारों, से पीड़ित रोगियों की प्रबल शिकायत कर रहे हैं। उदाहरण के लिए, IBS के रोगियों (पेट क्षेत्र के टटोलने का कार्य करने के लिए यानी, कोमलता) सामान्य आंत्र समारोह के दौरान गुदा गुब्बारा बढ़ाव और वृद्धि की संवेदनशीलता बढ़ प्रतिक्रियाओं सहित अतिसंवेदनशीलता,, साथ ही दैहिक सिफ़ारिश की अतिसंवेदनशीलता का प्रदर्शन एक। की, बेहतर समझ; कोलोरेक्टल afferents को लक्षित IBS के रोगियों में (guanylate साइक्लेस-सी एगोनिस्ट linaclotide 4-6 की मौखिक घूस जैसे, स्थानीय anesthetics 2,3 का इंट्रा-गुदा टपकाना) दर्द और अतिसंवेदनशीलता को समाप्त करने में कारगर साबित हो गया है क्योंकि colorectum की अभिवाही तंत्रिका वितरण महत्वपूर्ण है।
कोलोरेक्टल afferents सहित आंत afferents,, / रासायनिक nutrient- और थर्मल तौर तरीकों (जैसे, 7-9) का जवाब देने में सक्षम हैं। हालांकि, यांत्रिक उत्तेजनाओं (यानी, mechanosensitive afferents) का जवाब देने के आंत afferents किया गया है यांत्रिक उत्तेजनाओं (जैसे, luminal बढ़ाव, खिंचाव) आम तौर पर तकलीफ और दर्द 10-16 सहित होश में उत्तेजना, को जन्म दे रहे हैं कि उन क्योंकि सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किया। इसके अलावा, विसरा भी सामान्यतः, यंत्रवत् असंवेदनशील afferents (MIAs) द्वारा innervated मूक या सो nociceptors 17 कहा जाता है। सामान्य शारीरिक शर्तों के तहत, MIAs यांत्रिक उत्तेजना का जवाब या बहुत अधिक प्रतिक्रिया 18 थ्रेसहोल्ड है, लेकिन सक्रिय हो जाते हैं और pathophysiological परिस्थितियों में mechanosensitivity अधिग्रहण और अतिसंवेदनशीलता के लिए योगदान कर सकते हैं नहीं है।
यहाँ वर्णित इन विट्रो तैयारी और प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम विकसित किया है और समुद्र में एक बिजली के प्रोत्साहन रणनीति कार्यरत colorectum 19 में दोनों mechanosensitive और मिया अंत की निष्पक्ष पहचान देने के लिए उड़ान ग्रहणशील अंत, के लिए आरसीएच। कोलोरेक्टल स्फूर्तिदान काठ का आंत-संबंधी (LSN) और श्रोणि तंत्रिका (पीएन) के रास्ते से प्राप्त होता है, और पाँच mechanosensitive वर्गों (serosal, श्लैष्मिक, मांसपेशियों, मांसपेशियों-श्लैष्मिक, मेसेंतेरिक) और एक मिया कक्षा 20 में वर्गीकृत किया जा सकता है कि कोलोरेक्टल afferents भी शामिल है। इस में इन विट्रो तैयारी का उपयोग करना, हम कोलोरेक्टल MIAs का अधिग्रहण mechanosensitivity LSN मार्ग में पी.एन. मार्ग में MIAs का 71% और MIAs का 23% अवगत जो एक भड़काऊ सूप (है), के लिए अपने ग्रहणशील क्षेत्रों का संक्षिप्त प्रदर्शन के बाद (संवेदनशील बनाना) में पाया गया कि 19। हम भी लंबे समय से स्थायी व्यवहार आंत अतिसंवेदनशीलता के संदर्भ में MIAs की लंबी अवधि के संवेदीकरण (अप करने के लिए 28 दिन) प्रलेखित (zymosan 21 या 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic एसिड के साथ intracolonic उपचार प्राप्त चूहों में, यानी (TNBS) 22) ।
mechanosensitive afferents, मांसपेशियों और मांसपेशियों-श्लैष्मिक afferents अलावा jove_content "> (यानी, खिंचाव के प्रति संवेदनशील होते हैं) और हानिकारक कोलोरेक्टल बढ़ाव 23,24 की एन्कोडिंग साधन बनना tonically colorectum की परिधीय खिंचाव सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि केवल कक्षाओं कर रहे हैं। एक कंप्यूटर नियंत्रित का उपयोग करना बल actuator, हम चपटी कोलोरेक्टल ऊतक के परिधीय दिशा में एक मानक, सजातीय, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ramped खिंचाव आवेदन किया है और आगे खिंचाव के प्रति संवेदनशील afferents के रूप में कम-सीमा और उच्च दहलीज 23 श्रेणीबद्ध किया। इसके अलावा, खिंचाव के संवेदीकरण के समय के पाठ्यक्रम intracolonic zymosan 21 या TNBS 22 उपचार के बाद -sensitive afferents आंत का दर्द और अतिसंवेदनशीलता में खिंचाव के प्रति संवेदनशील कोलोरेक्टल afferents की भूमिका सुझाव दे, व्यवहार आंत अतिसंवेदनशीलता की शुरुआत, दृढ़ता, और / या वसूली से मेल खाती है।Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ वर्णित इन विट्रो colorectum-तंत्रिका तैयारी अच्छी तरह से आंत का संवेदी न्यूरॉन्स पर अन्य गैर कार्यात्मक दृष्टिकोण (जैसे, सेलुलर आणविक, और histological अध्ययन) का पूरक है जो व्यक्ति कोलोरेक्टल afferents, के तंत्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIH award R01 DK093525 (GFG). We greatly appreciate the scientific review and grammatical editing of the manuscript by Dr. Amber Shaffer (University of Pittsburgh) and thank Michael Burcham for assistance in preparation of figures.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Leica MZ16 stereo microscope | Leica Microsystems Inc. | ||
| Leica IC D camera | Leica Microsystems Inc. | ||
| Amplifier | World Precision instruments, Inc. | SYS-DAM80 | Low-noise differential amplifier |
| Two-compartment tissue chamber | Custom made | ||
| Power1401 | Cambridge Electronic Design Limited | Power1401 | Data acquisition, analog signal input/out |
| Spike2 v5.02 | Cambridge Electronic Design Limited | Software package that works with the Power1401 | |
| Audio monitor | Natus | Am 8 | |
| Square pulse stimulator | Natus | S48 | To deliver electrical stimuli |
| Photoelectric isolation unit | Natus | PSIU6 | Stimulus isolation to reduce noise |
| Concentric bipolar microelectrode | FHC Inc. | CBFFG75 | To deliver electrical stimuli |
| Dual-mode lever system | Aurora Scientific Inc. | Series 300C | To deliver mechanical stimuli |
| forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | forceps with fine tips |
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