In vitro functionele karakterisering van de Muis Colorectale Afferent Endings
Summary
This video demonstrates a protocol for conducting single-fiber electrophysiological recordings on an in vitro mouse colorectum-nerve preparation.
Abstract
Deze video toont in detail een in vitro single-fiber elektrofysiologische opname protocol met behulp van een muis colorectum-zenuw voorbereiding. De aanpak maakt het mogelijk onpartijdige identificatie en functionele karakterisatie van individuele colorectale afferenten. Extracellulaire opnames van gekweekte actiepotentialen (AP's) die afkomstig zijn van één of enkele afferente (dwz één vezel) receptieve velden (RFs) in de dikke darm zijn gemaakt van geplaagd zenuwvezel bundels. De dikke darm is verwijderd met ofwel het bekken (PN) of lumbale splanchnisch (LSN) zenuw bevestigd en lengterichting geopend. Het weefsel wordt in een opname kamer, vastgemaakt vlak en geperfuseerd met geoxygeneerde Krebs oplossing. Focal elektrische stimulatie wordt gebruikt om de colorectale afferente uitgangen, die verder worden getest door drie verschillende mechanische stimuli lokaliseren (blunt sonderen, mucosale strelen en omtrek rek) functioneel categoriseren afferente in vijf mechanosensitieve klassen. Endings reageren op geen van deze mechanische stimuli zijn gecategoriseerd als mechanisch-ongevoelige afferentia (MIA). Zowel mechanosensitieve en MIA kan worden beoordeeld sensibilisatie (bijv verbeterde respons, verminderde drempel en / of verwerving van mechanische gevoeligheid) van plaatselijke blootstelling van RFs voor chemicaliën (bijvoorbeeld inflammatoire soep (IS), capsaïcine, adenosine trifosfaat (ATP)). We beschrijven de apparatuur en de dikke darm-zenuw opname voorbereiding, de oogst van colorectum met aangehechte PN of LSN, identificatie van RFs in de dikke darm, single-fiber opname van zenuw bundels, en gelokaliseerde toepassing van chemicaliën om de RF. Bovendien worden problemen van het preparaat en gestandaardiseerde mechanische stimulatie besproken.
Introduction
Pijn en overgevoeligheid zijn de belangrijkste klachten van patiënten met functionele gastro-intestinale aandoeningen, waaronder prikkelbare darmsyndroom (IBS), die bestaan geen zichtbare pathobiological oorzaak of weefselschade. Bijvoorbeeld, IBS-patiënten vertonen overgevoeligheid, waaronder verhoogde respons op rectale ballondilatatie en verhoogde gevoeligheid tijdens normale darmfunctie, evenals overgevoeligheid somatische verwijzing (dwz tederheid palpatie van de buik) 1. Omdat targeting colorectale afferentia heeft bewezen effectief bij het verlichten van pijn en overgevoeligheid bij IBS-patiënten (bijvoorbeeld intra-rectale instillatie van lokale anesthetica 2,3; orale inname van de guanylaatcyclase-C-agonist linaclotide 4-6) te zijn, een beter begrip van de afferente innervatie van de dikke darm is belangrijk.
Visceraal afferente zenuwbanen, met inbegrip van colorectale afferenten, Kunnen reageren op chemische / voedselrijke en thermische modaliteiten (bijvoorbeeld 7-9). Echter, visceraal afferente zenuwbanen reageren op mechanische stimuli (dwz mechanosensitieve afferentia) zijn de meest grondig bestudeerd omdat mechanische stimuli (bv luminaal buik, stretch) zijn degenen die in het algemeen leiden tot bewuste sensaties, met inbegrip van ongemak en pijn 10-16. Daarnaast worden de ingewanden ook geïnnerveerd door het mechanisch ongevoelig afferenten (MIA), algemeen bekend als stille of slapen nociceptoren 17. Onder normale fysiologische omstandigheden, hoeft MIA niet reageren op mechanische stimulatie of hebben een zeer hoge respons drempels 18, maar kan actief worden en het verwerven van mechanische gevoeligheid in pathofysiologische omstandigheden en bij te dragen tot overgevoeligheid.
Met behulp van de in vitro voorbereiding en de hier beschreven protocol, we ontwikkeld en gebruikt een elektrische prikkel strategie naar zee RCH voor receptieve eindes, waardoor onpartijdige identificatie van zowel mechanosensitieve en MIA eindes in de dikke darm 19. De colorectale innervatie is afgeleid van lumbale splanchnisch (LSN) en bekkenzenuwstimulatie (PN) paden, en omvat colorectale afferentia die kunnen worden onderverdeeld in vijf mechanosensitieve klassen (serosal, mucosale, gespierd, gespierde-mucosale, mesenteriale) en een MIA klasse 20. Gebruik van deze in vitro bereiding, vonden we dat colorectale MIA verkregen mechanische gevoeligheid (gevoelig) na korte blootstelling hun receptieve velden een inflammatoire soep (IS), die 71% van MIA in de PN route en 23% van MIA in het LSN route gesensibiliseerde 19. We hebben ook gedocumenteerd langdurige sensibilisatie (tot 28 dagen) van MIA in de context van langdurige gedrags- viscerale hypersensitiviteit (dwz bij muizen die intracolonische behandelingen met zymosan 21 of 2,4,6-trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS) 22) .
jove_content "> Onder mechanosensitieve afferenten, gespierd en gespierd-mucosale afferentia zijn de enige klassen die tonisch coderen omtrek stuk van de dikke darm (dat wil zeggen, zijn stretch-gevoelig) en bevordelijk de codering van schadelijke colorectale uitzetting 23,24. Met behulp van een computer-gestuurde krachtactuator, pasten wij een standaard, homogene en reproduceerbare opgevoerd rek in de omtreksrichting van de afgeplatte colorectaal weefsel en verder onderverdeeld stretch-gevoelige afferente een lage drempel en hoge drempel 23. Bovendien, het tijdsverloop van sensibilisatie van stretch -gevoelige afferentia na intracolonische zymosan 21 of 22 TNBS behandeling is het begin, persistentie en / of herstel van gedrags- viscerale hypersensitiviteit, suggereert een rol van stretch-gevoelige colorectale afferenten in viscerale pijn en overgevoeligheid.Protocol
Representative Results
Discussion
De in vitro colorectum zenuw bereiding beschreven blijkt een krachtige aanpak om neurale codering functies van individuele colorectale afferenten, die mooi aanvulling andere niet-functionele benaderingen (bijvoorbeeld cellulaire, moleculaire en histologische studies) op viscerale sensorische neuronen (bestuderen zie beoordeling 27 voor details). Neuronale mechanismen die bijdragen aan nociceptie en langdurige colorectale overgevoeligheid zijn geopenbaard en farmacologische manipulaties zijn …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIH award R01 DK093525 (GFG). We greatly appreciate the scientific review and grammatical editing of the manuscript by Dr. Amber Shaffer (University of Pittsburgh) and thank Michael Burcham for assistance in preparation of figures.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Leica MZ16 stereo microscope | Leica Microsystems Inc. | ||
| Leica IC D camera | Leica Microsystems Inc. | ||
| Amplifier | World Precision instruments, Inc. | SYS-DAM80 | Low-noise differential amplifier |
| Two-compartment tissue chamber | Custom made | ||
| Power1401 | Cambridge Electronic Design Limited | Power1401 | Data acquisition, analog signal input/out |
| Spike2 v5.02 | Cambridge Electronic Design Limited | Software package that works with the Power1401 | |
| Audio monitor | Natus | Am 8 | |
| Square pulse stimulator | Natus | S48 | To deliver electrical stimuli |
| Photoelectric isolation unit | Natus | PSIU6 | Stimulus isolation to reduce noise |
| Concentric bipolar microelectrode | FHC Inc. | CBFFG75 | To deliver electrical stimuli |
| Dual-mode lever system | Aurora Scientific Inc. | Series 300C | To deliver mechanical stimuli |
| forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | forceps with fine tips |
References
- Naliboff, B. D., et al. Evidence for two distinct perceptual alterations in irritable bowel syndrome. Gut. 41, 505-512 (1997).
- Verne, G. N., Robinson, M. E., Vase, L., Price, D. D. Reversal of visceral and cutaneous hyperalgesia by local rectal anesthesia in irritable bowel syndrome (IBS) patients. Pain. 105, 223-230 (2003).
- Verne, G. N., Sen, A., Price, D. D. Intrarectal lidocaine is an effective treatment for abdominal pain associated with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome. Journal of Pain. 6, 493-496 (2005).
- Chey, W. D., et al. Linaclotide for irritable bowel syndrome with constipation: a 26-week, randomized, double-blind, placebo-controlled trial to evaluate efficacy and safety. Am J Gastroenterol. 107, 1702-1712 (2012).
- Rao, S., et al. A 12-week, randomized, controlled trial with a 4-week randomized withdrawal period to evaluate the efficacy and safety of linaclotide in irritable bowel syndrome with constipation. Am J Gastroenterol. 107, 1714-1724 (2012).
- Busby, R. W., et al. Pharmacologic properties, metabolism, and disposition of linaclotide, a novel therapeutic peptide approved for the treatment of irritable bowel syndrome with constipation and chronic idiopathic constipation. J Pharmacol Exp Ther. 344, 196-206 (2013).
- Mei, N. Intestinal chemosensitivity. Physiol Rev. 65, 211-237 (1985).
- Mei, N., Lucchini, S. Current data and ideas on digestive sensitivity. J Auton Nerv Syst. 41, 15-18 (1992).
- Su, X., Gebhart, G. F. Mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat are polymodal in character. J Neurophysiol. 80, 2632-2644 (1998).
- McMahon, S. B., Morrison, J. F. Spinal neurones with long projections activated from the abdominal viscera of the cat. J Physiol. 322, 1-20 (1982).
- Cervero, F., Sann, H. Mechanically evoked responses of afferent fibres innervating the guinea-pig’s ureter: an in vitro study. J Physiol. 412, 245-266 (1989).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Mechanosensitive properties of pelvic nerve afferent fibers innervating the urinary bladder of the rat. J Neurophysiol. 72, 2420-2430 (1994).
- Sengupta, J. N., Gebhart, G. F. Characterization of mechanosensitive pelvic nerve afferent fibers innervating the colon of the rat. J Neurophysiol. 71, 2046-2060 (1994).
- Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. Activation of unmyelinated afferent fibres by mechanical stimuli and inflammation of the urinary bladder in the cat. J Physiol. 425, 545-562 (1990).
- Habler, H. J., Janig, W., Koltzenburg, M. A novel type of unmyelinated chemosensitive nociceptor in the acutely inflamed urinary bladder. Agents Actions. 25, 219-221 (1988).
- Brierley, S. M., Jones, R. C., Gebhart, G. F., Blackshaw, L. A. Splanchnic and pelvic mechanosensory afferents signal different qualities of colonic stimuli in mice. Gastroenterology. 127, 166-178 (2004).
- Meyer, R. A., Davis, K. D., Cohen, R. H., Treede, R. D., Campbell, J. N. Mechanically insensitive afferents (MIAs) in cutaneous nerves of monkey. Brain Res. 561, 252-261 (1991).
- Handwerker, H. O., Kilo, S., Reeh, P. W. Unresponsive afferent nerve fibres in the sural nerve of the rat. J Physiol. 435, 229-242 (1991).
- Feng, B., Gebhart, G. F. Characterization of silent afferents in the pelvic and splanchnic innervations of the mouse colorectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G170-G180 (2011).
- Feng, B., La, J. H., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Irritable bowel syndrome: methods, mechanisms, and pathophysiology. Neural and neuro-immune mechanisms of visceral hypersensitivity in irritable bowel syndrome. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G1085-G1098 (2012).
- Feng, B., et al. Long-term sensitization of mechanosensitive and -insensitive afferents in mice with persistent colorectal hypersensitivity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302, G676-G683 (2012).
- Feng, B., et al. Altered colorectal afferent function associated with TNBS-induced visceral hypersensitivity in mice. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G817-G824 (2012).
- Feng, B., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. Differential roles of stretch-sensitive pelvic nerve afferents innervating mouse distal colon and rectum. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 298, G402-G409 (2010).
- Feng, B., et al. Activation of guanylate cyclase-C attenuates stretch responses and sensitization of mouse colorectal afferents. J Neurosci. 33, 9831-9839 (2013).
- Jolliffe, I. T. . Principal component analysis. , (2002).
- La, J. H., Feng, B., Schwartz, E. S., Brumovsky, P. R., Gebhart, G. F. Luminal hypertonicity and acidity modulate colorectal afferents and induce persistent visceral hypersensitivity. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303, G802-G809 (2012).
- Christianson, J. A., et al. plasticity and modulation of visceral afferents. Brain Research Reviews. 60, 171-186 (2009).
- Kiyatkin, M. E., Feng, B., Schwartz, E. S., Gebhart, G. F. Combined genetic and pharmacological inhibition of TRPV1 and P2X3 attenuates colorectal hypersensitivity and afferent sensitization. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305, G638-G648 (2013).
- Brumovsky, P. R., Feng, B., Xu, L., McCarthy, C. J., Gebhart, G. F. Cystitis increases colorectal afferent sensitivity in the mouse. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297, G1250-G1258 (2009).
- Shinoda, M., Feng, B., Gebhart, G. F. Peripheral and central P2X receptor contributions to colon mechanosensitivity and hypersensitivity in the mouse. Gastroenterology. 137, 2096-2104 (2009).
- Tanaka, T., Shinoda, M., Feng, B., Albers, K. M., Gebhart, G. F. Modulation of visceral hypersensitivity by glial cell line-derived neurotrophic factor family receptor α-3 in colorectal afferents. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G418-G424 (2011).
