This paper describes the cryo-electron microscopy methodology, which is used to obtain high quality microscopic images of macromolecules in their near-native state. The method yields images suitable for further computerized processing using the single particle approach, devised to generate the 3D reconstruction of a macromolecule.
Cryo-electron microscopy (cryoEM) entails flash-freezing a thin layer of sample on a support, and then visualizing the sample in its frozen hydrated state by transmission electron microscopy (TEM). This can be achieved with very low quantity of protein and in the buffer of choice, without the use of any stain, which is very useful to determine structure-function correlations of macromolecules. When combined with single-particle image processing, the technique has found widespread usefulness for 3D structural determination of purified macromolecules.
The protocol presented here explains how to perform cryoEM and examines the causes of most commonly encountered problems for rational troubleshooting; following all these steps should lead to acquisition of high quality cryoEM images. The technique requires access to the electron microscope instrument and to a vitrification device. Knowledge of the 3D reconstruction concepts and software is also needed for computerized image processing. Importantly, high quality results depend on finding the right purification conditions leading to a uniform population of structurally intact macromolecules.
The ability of cryoEM to visualize macromolecules combined with the versatility of single particle image processing has proven very successful for structural determination of large proteins and macromolecular machines in their near-native state, identification of their multiple components by 3D difference mapping, and creation of pseudo-atomic structures by docking of x-ray structures. The relentless development of cryoEM instrumentation and image processing techniques for the last 30 years has resulted in the possibility to generate de novo 3D reconstructions at atomic resolution level.
cryoEM के लक्ष्य को उनके पैतृक हाइड्रेटेड राज्य में अणुओं की इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म छवियों को प्राप्त करने के लिए है। Vitrified पानी में macromolecule embedding के आधार पर, एक जमे हुए हाइड्रेटेड नमूना सीधे पेश किया जा सकता है और मंदिर साधन में कल्पना की। कांच में रूपांतर, ठंड फ्लैश (10,000 ओ सी / एसईसी) द्वारा हासिल की, पानी क्रिस्टलीकरण बिना नमूना जमा देता है और ठंड के दौरान आणविक rearrangements नगण्य हैं कि सुनिश्चित करता है। आसपास के बफर के संबंध में नमूने के इलेक्ट्रॉन बिखरने के अतिरिक्त किसी भी दाग एक के अभाव में macromolecule को देखने के लिए एक छोटी लेकिन पर्याप्त विपरीत प्रदान करता है। कम्प्यूटरीकृत इमेज प्रोसेसिंग फिर macromolecule '3 डी संरचना विश्राम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ~ 500 kDa- बहु एमडीए रेंज में बड़े बड़े अणुओं (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी डाटा बैंक (EMDB) प्रविष्टियों में से 80% से अधिक का प्रतिनिधित्व) cryoEM के लिए आदर्श नमूने हैं; ये प्रोटीन, प्रोटीन परिसरों, प्रोटीन-न्यूक्लिक एसिड शामिल गomplexes, और झिल्ली प्रोटीन एक bilayer में एम्बेडेड। इन अणुओं (पी डी बी डेटाबेस में कम से कम 2% प्रविष्टियों के साथ) सघन किए जाने की संभावना कम होती है अभी तक यह एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी या एनएमआर द्वारा हल छोटे टुकड़ों cryoEM द्वारा बनाई गई 3 डी लिफाफे में डॉक किया जा सकता है कि अक्सर मामला है। दूसरी ओर, cryoEM द्वारा हल के सबसे बड़े संरचनाओं में से कुछ पतली धारा मंदिर 2 से भरा कोशिका के भीतर से पहचाने जाने योग्य हैं। इस प्रकार, cryoEM प्रभावी ढंग से subcellular और परमाणु संरचना के बीच आकार और संकल्प की खाई को पुल।
CryoEM दाग बहिष्कार का क्षेत्र एक जोरदार विषम "नकारात्मक" छवि 3 बनाता है जिससे macromolecule निर्जलित और भारी धातु दाग की एक परत से घिरा हुआ है, जहां नकारात्मक धुंधला की अधिक शास्त्रीय विधि (एन एस), की तुलना में बेहतर macromolecule देशी संरचना को दर्शाता है। दोनों ही मामलों में इलेक्ट्रॉन बीम अणुओं की 2D प्रक्षेपण छवियों कहा जाता है, कण, जहां का उत्पादनहेप इलेक्ट्रॉन बीम के लिए सम्मान के साथ macromolecule के उन्मुखीकरण पर निर्भर करता है। कई कणों, कम से कम ~ 1000 और कोई ऊपरी सीमा के साथ, शोर अनुपात (SNR) औसत हालांकि करने के लिए संकेत को बढ़ाने के लिए, और कण के स्थानिक उन्मुखीकरण मापदंडों को खोजने के लिए 'एकल कण विश्लेषण' (एसपीए) सॉफ्टवेयर के साथ कंप्यूटर पर विश्लेषण किया जा सकता वापस प्रक्षेपण 4-7 से macromolecule '3 डी संरचना विश्राम करने की जरूरत है। उच्च SNR के साथ एन एस, प्रारंभिक नमूना लक्षण वर्णन के लिए प्रयोग किया जाता है और एक नए सिरे से 3 डी पुनर्निर्माण उत्पन्न करने के लिए; अपने संकल्प को शायद ही कभी भारी धातु अनाज के निर्जलीकरण और आकार द्वारा लगाया गया है जो 20 ए, से अधिक है। सामान्य में, cryoEM 3 डी संरचनात्मक निर्धारण के लिए, एक कम संकल्प 3D पुनर्निर्माण, पहले एन एस से प्राप्त किया जाता है और फिर cryoEM आगे इसकी आंतरिक संरचना को देखने के लिए, अपने मूल हाइड्रेटेड राज्य में macromolecule अध्ययन करने के लिए यह कम संकल्प प्रारंभिक नक्शा परिष्कृत करने के लिए प्रयोग किया जाता है और अपने संकल्प को बढ़ाने के लिए। नाते कि एन एस मॉडल विकृत किया गया था (सबसे आम उदाहरण निर्जलीकरण 8 से उत्पन्न सपाट है) और cryoEM कणों कम SNR, तो विरूपण कम SNR में आम है जो cryoEM मॉडल (मॉडल-पूर्वाग्रह विरूपण साक्ष्य, में ले सकता था अगर डेटासेट 9)। स्ट्रक्चरल विरूपण एनएस और cryoEM कच्चे कणों के बीच और कच्चे cryoEM कणों और सपाट दिशा के orthogonal 3 डी मॉडल की इसी अनुमानों के बीच बेमेल नतीजा होगा। 3 डी मॉडल लगातार शोधन चक्र से होकर गुजरती है के रूप में मॉडल पूर्वाग्रह से ही हल हो सकती है। कि 3 डी मॉडल से कच्चे cryoEM कणों और इसी के अनुमानों के बीच पत्राचार की कमी के रूप में पहचान की जाएगी, जो घटित नहीं होना चाहिए, तो एक नए सिरे से मॉडल cryoEM डेटा से निर्माण किया जाना चाहिए। एक अच्छा दृष्टिकोण सर्वोत्तम संभव cryoEM मॉडल का चयन करने के लिए कई संभव 3 डी संस्करणों उपज हो सकती है जो कोणीय पुनर्गठन एल्गोरिथ्म 10, उपयोग, और फिर एन एस 3 डी मॉडल का उपयोग करने के लिए हो सकता हैकि 11 आगे परिष्कृत किया जाएगा। एक और भी बेहतर रणनीति (चर्चा में समर्पित अनुभाग देखें) cryoEM डाटासेट की SNR बढ़ाने के लिए है।
शुद्ध macromolecule के जैव रासायनिक गुणवत्ता अंतिम परिणाम में एक अत्यंत प्रभाव है। macromolecule, heterologous प्रणालियों में ऊतक से शुद्ध या व्यक्त की, पवित्रता की एक उच्च डिग्री है और structurally बरकरार होने की जरूरत है। यह न तो समुच्चय फार्म चाहिए और न ही यह disaggregate चाहिए। एक विशेष रचना को परिभाषित करने के लिए, तैयारी शर्तों में एक समान गठनात्मक राज्य को बढ़ावा देना चाहिए। परिसरों का अध्ययन करने के लिए, इसे अन्यथा fixatives सफलतापूर्वक कम आत्मीयता बातचीत 12,13 स्थिर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, उनके कश्मीर डी एनएम रेंज में है कि हो सकता है।
Unprocessed cryoEM छवियों आयामों पर बहुमूल्य जानकारी, सामान्य रूपरेखा, एकत्रीकरण / multimerization, एकरूपता के राज्य, और macromolecu की आंतरिक संरचना उपजLe। फिर भी तकनीक की क्षमता बेहद छवि प्रसंस्करण के साथ बढ़ाया है। एक 3 डी संरचना macromolecule के समग्र वास्तुकला, ligands और सब यूनिटों, गठनात्मक परिवर्तन के 3 डी स्थान का पता चलता है, और एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी या एनएमआर द्वारा निर्धारित परमाणु संरचना की डॉकिंग में सक्षम बनाता है। संकल्प में वृद्धि हुई है के रूप में एक 3 डी पुनर्निर्माण की राशि की जानकारी stepwise बढ़ जाती है: जनरल 15-20 एक संकल्प में 9-10 एक अल्फा helices पर, परमाणु संरचना की स्पष्ट डॉकिंग परमिट 5 में यह विचार करने के लिए संभव है, छड़ के रूप में दिखाई दे रहे हैं बीटा चादरें, और 3.5 ए और बेहतर के प्रस्तावों पर यह एक परमाणु मॉडल 14 का निर्माण संभव है।
संभावना कम से कम 0.05 मिलीग्राम की 3-5 μl के रूप में / एमएल एक मंदिर ग्रिड तैयार करने के लिए पर्याप्त हैं, जानकारीपूर्ण छवियों और cryoEM एक आकर्षक तकनीक बनाने के नमूने की अपेक्षाकृत कम मात्रा से स्पा का उपयोग कर एक 3 डी पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए। न्यूनतम वाद्य आवश्यकताओंcryoEM के लिए एक घर का बना या वाणिज्यिक क्रायो-सवार, अति उच्च निर्वात, छवि रिकॉर्डिंग मीडिया और कम खुराक किट, इसकी पम्पिंग स्टेशन, एक चमक निर्वहन तंत्र के साथ एक क्रायो धारक, और एक बाष्पीकरण के साथ एक इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप हैं। मंदिर पर गैर जरूरी है, लेकिन आगे वांछनीय विशेषताएं (सभी आधुनिक tems में वर्तमान) सीसीडी कैमरा या एक प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टर, क्षेत्र उत्सर्जन बंदूक (FEG), ऊर्जा छानने, और उच्च throughput डेटा संग्रह सॉफ्टवेयर रहे हैं। सिद्धांत रूप में यह सॉफ्टवेयर हालांकि बढ़ डेटा भंडारण की जरूरत है और बाद में देखरेख पोस्ट प्रसंस्करण समय की आवश्यकता को ध्यान में रखा जाना करने के लिए, एक एकल cryoEM सत्र 15 में दसियों कणों के हजारों के इकट्ठा करने में सक्षम बनाता है। इसके विपरीत हस्तांतरण समारोह (CTF) सुधार के साथ संयुक्त FEG helices अल्फा कल्पना करने के लिए पर्याप्त संकल्प पर पहुंच गया है कि सबसे अधिक 3 डी पुनर्निर्माण underlies। उस समय, संकल्प का स्तर भी नमूना पर निर्भर है: 10 एक संकल्प तक पहुँचने झिल्ली प्रोटीन के लिए कम आम है, जबकि अगरसमरूपता के उच्च क्रम परमाणु संकल्प अधिक प्राप्त है तो मौजूद है। प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों की हाल ही में विकास cryoEM इलेक्ट्रॉन घनत्व नक्शे की गुणवत्ता इन एक्स-रे विवर्तन डेटा 16,17 से व्युत्पन्न से मेल खाता है, जहां (4x) कम या कोई समरूपता, के साथ भी बड़े अणुओं के लिए संकल्प परमाणु सक्षम है।
तकनीक की क्षमताओं illustrating व्यावहारिक उदाहरण cryoEM उनकी संरचनात्मक दृढ़ संकल्प में एक सतत प्रमुख भूमिका है, जहां बड़े अणुओं के चार महत्वपूर्ण प्रकार के लिए यहाँ प्रदान की जाती हैं। 60 गुना और वफादार और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संरेखण कि परमिट उनके बड़े आकार के द्वारा डाटासेट बढ़ जाती है कि उनके icosahedral समरूपता के साथ (मैं), कई icosahedral वायरस की संरचना एसपीए 18 द्वारा पीछा cryoEM द्वारा पास परमाणु संकल्प को हल किया गया है। हम icosahedral वायरस, एडिनो से जुड़े वायरस (AAVs) के एक वर्ग का एक उदाहरण है, जो शो के लिए cryoEM द्वारा और cryoEM / एक्स-रे हरियाणा द्वारा पास परमाणु संरचनाBrid विधियों 19,20 मौजूद हैं। (Ii) के पेचदार संरचना के साथ अणुओं सूक्ष्मनलिकाएं, तंतु और वायरस शामिल हैं। पेचदार धुरी के साथ उनके दोहराव इकाइयों पेचदार ज्यामिति 21 के लिए अनुकूलित स्पा की एक अधिक जटिल संस्करण से विश्लेषण किया जा सकता है। उदाहरण में हम तंबाकू मोज़ेक वायरस (TMV), cryoEM 22 से परमाणु संकल्प को हल किया गया है कि एक शाही सेना वायरस दिखा। (Iii) के बड़े घुलनशील प्रोटीन कथन से अध्ययन किया गया है। इन के अलावा, सममित multimeric सिलेंडरों के गठन अणुओं अक्सर subnanometer संकल्प 23,24 पर हल एक आवर्ती वास्तुकला का गठन। यहाँ हम एक संकर आणविक मॉडल cryoEM / एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी संकर विधियों 25 से बनाया गया था, जहां KLH, एक अकशेरुकी ऑक्सीजन वाहक, की छवियों को दिखाने के लिए। (चतुर्थ) झिल्ली प्रोटीन प्रोटीन का एक महत्वपूर्ण वर्ग के हैं; वे मानव जीनोम द्वारा कोडित प्रोटीन के बारे में 1/3 का गठन, फिर भी वे कारण tr के साथ जुड़े जटिलताओं के संरचनात्मक रूप चिह्नित करने के लिए मुश्किल हो जाता हैसंयुक्त किसी भी संरचनात्मक तकनीक के द्वारा हल संरचनाओं के कम से कम 1.5% का गठन ansmembrane डोमेन स्थिरीकरण 26। उनकी संरचनात्मक निर्धारण में cryoEM और 3 डी पुनर्निर्माण की भूमिका ryanodine रिसेप्टर (RyR), मांसपेशियों में संकुचन और मस्तिष्क संकेतन में महत्वपूर्ण एक बड़ी यूकेरियोटिक इंट्रासेल्युलर सीए 2 + चैनल के साथ उदाहरण है। तिथि करने के लिए उच्चतम संकल्प cryoEM संरचनाओं, 10 एक संकल्प के साथ, माध्यमिक संरचना 27 प्रकट करते हैं।
स्पा द्वारा पीछा मंदिर एक दिया macromolecule के लिए, एक कम संकल्प 3 डी संरचना पहले एक higher- द्वारा पीछा किया जा सकता है, जो एन एस डेटा, से निर्धारित किया जाता है, सामान्य तौर पर मध्य 2014 तक EMDB में 2000 प्रविष्टियों में होने जा रही है, कई macromolecular 3 डी संरचनाओं योगदान दिया है संकल्प cryoEM 3 डी संरचना। पहली 3 डी पुनर्निर्माण की सुविधा है, जो एन एस, द्वारा प्रदान की आणविक सीमाओं की उच्च विपरीत, बाद में इसकी इसकी पूरी तरह से हाइड्रेटेड राज्य में macromolecule की आंतरिक संरचना को मैप करने की क्षमता है, और बहुत उच्च संकल्प को प्राप्त करने की संभावना के साथ cryoEM से परिष्कृत किया जाता है। CryoEM का एक और लाभ macromolecule के पतन में परिणाम सकता है कि निर्जलीकरण तनाव का उन्मूलन है। इसके अलावा, संभव सतह अवशोषण प्रभाव समाप्त और macromolecule समाधान में गोद ले कि रचना से पता चलता है जो कार्बन समर्थन, न आना करने की संभावना नहीं है। क्रायो-नकारात्मक धुंधला, cryoEM और एन एस का एक संयोजन, एक पूरी तरह से Hyd में उच्च विपरीत परमिटनमूना मूल्यांकन और दाग खुद macromolecule 31 की अखंडता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, क्योंकि यह भी हिस्से में, कम से कम 10 EMDB प्रविष्टियों के साथ, लेकिन यह कम बार इस्तेमाल किया गया है, एसपीए का उपयोग कर 3D पुनर्निर्माण के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। 3D पुनर्निर्माण के लिए अनुकूल दो अन्य मंदिर तकनीक 2D इलेक्ट्रॉन क्रि और इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी हैं। 2 डी इलेक्ट्रॉन क्रि एक planar या ट्यूबलर क्रिस्टल की आवश्यकता है; क्रिस्टल की इलेक्ट्रॉन विवर्तन संभावित परमाणु संकल्प 32 के लिए अग्रणी 3D पुनर्निर्माण के लिए प्रयोग किया जाता है। Vitrified या पारंपरिक रूप से तय नमूनों की इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी में, एक macromolecule या उप सेलुलर घटक विलक्षण वस्तुओं खंगाला जा सकता है कि लाभ के साथ, बाद में tomographic पुनर्निर्माण 33 के लिए मंदिर के अंदर घुमाया जा रहा है; हालांकि वर्तमान में इस तकनीक को एक 34,35 40-20 लेकर एक संकल्प सीमा होती है। इन सभी आणविक मंदिर तकनीकों के अलावा, एन एस और cryoEM डेटा के स्पा सबसे व्यापक रूप से किया गया हैइस्तेमाल किया। यहाँ सचित्र प्रोटोकॉल एसपीए के विश्लेषण के लिए उपयुक्त cryoEM छवियों को प्राप्त करने के लिए समर्पित है; फिर भी प्रोटोकॉल के अधिकांश भी cryoEM 2 डी के क्रिस्टल और tomographic नमूने के लिए लागू है।
एक सफल cryoEM सत्र में कई महत्वपूर्ण कदम के संयुक्त सफलता पर निर्भर करता है; महत्वपूर्ण पहलुओं को ध्यान में रखना आम cryoEM कलाकृतियों की व्याख्या करने और उन्हें निम्नलिखित पैराग्राफ में वर्णित हैं से बचने के लिए कैसे करने के लिए। इस अनुभाग में भी एसपीए विधि का उपयोग कर उच्च गुणवत्ता वाले 3 डी पुनर्निर्माण प्राप्त करने के लिए डेटा संग्रह के दिशा निर्देशों का वर्णन करता है।
बर्फ क्रिस्टलीय को संक्रमण से बचें। एक केंद्रीय पहलू नमूना क्रायो डूबनेवाला मंदिर अवलोकन भर के क्षण से कांच का राज्य में रहने की जरूरत है। इस प्रकार तरल एटैन में नमूना डूबनेवाला के बाद बाद के सभी चरणों को तरल नाइट्रोजन (-196 डिग्री सेल्सियस) या तरल हीलियम (-269 डिग्री सेल्सियस) तापमान पर प्रदर्शन कर रहे हैं। -135 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के लिए वार्मिंग में कांच का पानी बदल देती हैक्रिस्टलीय पानी के लिए; फिर macromolecular rearrangements जगह ले सकता है और पानी क्रिस्टल छवि (चित्रा 3A) हावी; नमूना खारिज किया जाना चाहिए। हैंडलिंग चिमटी अपर्याप्त पूर्व थे अगर दुर्घटना नमूना वार्म अप क्रायो डूबनेवाला, मंदिर में (एक gridbox द्वारा संरक्षित भी अगर) कंटेनर, और / या क्रायो धारक प्रविष्टि के बीच जमी ग्रिड का हस्तांतरण भी धीमी गति से कर रहे हैं हो सकता है, या कर सकता है ठंडा। क्रायो-हस्तांतरण पर मंदिर में महत्वपूर्ण वैक्यूम गिरावट (ठंड नमूना जाल गरम आने वाली हवा) भी नमूना तक गर्म हो सकता है। अंत में, अधिक विकिरण का नमूना भी बर्फ क्रिस्टलीय के लिए संक्रमण में परिणाम सकता है।
बर्फ संदूषण को कम। छोटा सा नमूना मात्रा (3-5 μl) मंदिर ग्रिड के लिए लागू देखते हुए, वाष्पीकरण बफर घटकों (नमक, डिटर्जेंट) ध्यान केंद्रित करने और इस प्रकार multimeric राज्य के नुकसान सहित macromolecular अखंडता को प्रभावित कर सकता है। एक उच्च सापेक्ष आर्द्रता (आरएच) microenvironment या चैम्बर दरकिनारइस समस्या। वैकल्पिक रूप से क्रायो डूबनेवाला एक पर्याप्त हवादार पर्यावरण ठंडे कमरे में किया जा सकता है। क्रायो डूबनेवाला आरएच के बाद खुद को एक ठंड जाल के रूप में कार्य करता है क्रायो ग्रिड के रूप में, बर्फ संदूषण, या क्रायो ग्रिड पर परिवेश नमी का संक्षेपण को रोकने के लिए संभव के रूप में कम किया जाना चाहिए। आइस संदूषण उच्च विपरीत और 5 ~ के बीच एनएम लेकर आकार और के साथ हस्तक्षेप या यहां तक कि पूरी तरह से छवि ब्लॉक कि कई माइक्रोन के साथ कोई बुनियाद के साथ कणों के होते हैं। हवा स्थानांतरण के दौरान क्रायो ग्रिड की दिशा में साँस लेने / बात कर, हवा ड्राफ्ट से बचें, और परिवेश आरएच कम। (सफेद निलंबित कणों के रूप में दिखाई) गाढ़ा पानी के साथ ओपन तरल नाइट्रोजन कंटेनर भी खारिज किया जाना चाहिए।
Macromolecular झुकाव / विचार अधिकतम करें। नमूना समर्थन के लिए, किए जाने के लिए एक विकल्प सच छेददार ग्रिड और छेददार ग्रिड से अधिक पतली कार्बन के बीच है। यह नमूना कार्बन छेद बनाम कार्बन फिल्म में फैलता कैसे (मैं), (द्वितीय) उपलब्ध नमूना conce पर निर्भर करता हैntration, के रूप में नंगे छेद छवि पर एक समान कण घनत्व के लिए कार्बन समर्थन की तुलना में अधिक एकाग्रता के 100X आवश्यकता हो सकती है (~ से 0.02 माइक्रोन से 2), और (iii) macromolecule झुकाव का वितरण कैसे यादृच्छिक है। कार्बन हाइड्रोफिलिक बनाता है जो कि चमक निर्वहन, नोट, सभी तीन पहलुओं में एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ेगा और इस नमूने पर निर्भर हो जाएगा। उच्च संकल्प के लिए 3 डी पुनर्निर्माण को परिष्कृत करते समय एक आवर्तक देखें यादृच्छिक शंक्वाकार पुनर्निर्माण द्वारा प्रारंभिक संरचनात्मक निर्धारण के लिए वांछनीय है, जबकि macromolecule के उन्मुखीकरण के बारे में, macromolecular विचारों के randomness वांछनीय है। हमारे उदाहरण में, RyR1 पसंदीदा 'चौगुना' दृश्य (चित्रा 2 डी) के साथ कार्बन के साथ सूचना का आदान प्रदान और झुकाव के randomness और उच्च संकल्प 36 के लिए छेददार ग्रिड की आवश्यकता है।
SNR है। SNR बढ़ाने के लिए सबसे अच्छी रणनीति शोर की पृष्ठभूमि के स्रोतों को कम करने के लिए है अधिकतम करें। अत्यधिक बर्फमोटाई और क्या जरूरत है परे कार्बन फिल्म मोटाई का समर्थन और प्रोटीन अतिरिक्त शोर जोड़ देगा एम्बेड करने के लिए (यदि उपस्थित हो)। इस प्रकार बर्फ की मोटाई सोख्ता समय, दबाव, आरएच, और फिल्टर पेपर की गुणवत्ता को नियंत्रित करने से न्यूनतम आवश्यक करने के लिए कम किया जाना चाहिए। कार्बन समर्थन के लिए, एक पतली (~ 5 एनएम) कार्बन फिल्म मोटा छेददार कार्बन फिल्म पर स्तरित है: नमूना पतली कार्बन से ढके छेद पर imaged है, जबकि मोटी छेददार कार्बन यांत्रिक प्रतिरोध प्रदान करता है। दूसरी ओर, कि अत्यंत पतली बर्फ ध्यान दें और / या कार्बन एक वेब (चित्रा 3 डी) में बदल सकते हैं कि एक आसानी से टूट समर्थन में हो सकता है। SNR को अधिकतम करने के लिए, किसी भी अनावश्यक बफर घटकों से बचा जाना चाहिए। झिल्ली प्रोटीन के लिए, डिटर्जेंट इसके विपरीत पर एक महत्वपूर्ण टोल (चित्रा 2 डी, सही पैनल देखें) लेता है। सतह के तनाव को कम करने से इसके अलावा डिटर्जेंट नमूना समर्थन पर फैलता है जिस तरह बदल जाता है। कुछ झिल्ली प्रोटीन det के अलावा लिपिड की उपस्थिति की आवश्यकताआगे इसके विपरीत कम कर देता है जो ergent,। इस नमूने काबू पाने के लिए सिर्फ 37 क्रायो डूबनेवाला से पहले कम डिटर्जेंट एकाग्रता के साथ और लिपिड के बिना एक बफर में पतला किया जा सकता है। नए वैकल्पिक डिटर्जेंट 16 और transmembrane डोमेन घटक को स्थिर करने के nanodisks 38 के उपयोग cryoEM द्वारा इमेजिंग झिल्ली प्रोटीन के लिए सफल दृष्टिकोण होना दिखाई देते हैं।
उच्च गुणवत्ता के चित्र के लिए प्रयास करते हैं और CTF सुधार के लिए तैयार करते हैं। Vitrified नमूनों, जिस पर कोई नहीं है इंगित, CTF, आवृत्ति को तीव्रता से संबंधित है कि समारोह, कई शून्य संक्रमण है, जहां विपरीत पर्याप्त छवि (चरण) उत्पन्न करने के लिए उच्च defocus मूल्यों की आवश्यकता इंफॉर्मेशन। CTF सुधार कम संकल्प 3D पुनर्निर्माण के लिए आवश्यक नहीं है जबकि उच्च संकल्प के लिए लक्ष्य, जब 3D वस्तु का सही प्रतिनिधित्व ठीक करने के लिए, विभिन्न defoci साथ छवियों कम्प्यूटेशनल CTF सुधार किया जा सकता है, ताकि एकत्र करने की आवश्यकता है।CTF दृढ़ संकल्प और सुधार प्रमुख एसपीए सॉफ्टवेयर संकुल 07/04 में शामिल है; विवरण कहीं और 39 पाया जा सकता है। इष्टतम CTF सुधार के लिए, defoci की एक सीमा का उपयोग करें। एक अच्छी रणनीति 3-4 defocus मूल्यों के बीच वैकल्पिक करने के लिए है। मूल्यों, बर्फ / कार्बन मोटाई (पतले नमूना कम defocus की आवश्यकता है), और वोल्टेज (कम वोल्टेज कम defocus की आवश्यकता है) macromolecule (बड़े आकार कम defocus की आवश्यकता होती है) के आकार पर निर्भर करते हैं। 200 केवी के लिए, मूल्यों का एक अच्छा प्रारंभिक सीमा 2.5, 3, 3.5 और 4 माइक्रोन defocus है। CTF पारस्परिक अंतरिक्ष प्रतिनिधित्व, बिजली स्पेक्ट्रम में (Thon 40 छल्ले) उच्च और निम्न तीव्रता के छल्ले बारी के रूप में प्रकट होता है। समाधान के लिए संभावित खोलेगा बिजली स्पेक्ट्रम प्रदर्शित; व्यापक दिखाई दे Thon अंगूठी की आवृत्ति प्राप्य संकल्प की एक प्राथमिकताओं का अनुमान है सबसे करीब है। बिजली स्पेक्ट्रम समय-समय पर जाँच की, और विदृष्टिक (गैर परिपत्र) Thon छल्ले किया जाना चाहिए (चित्रा 3सी) उद्देश्य stigmator साथ सही किया जाना चाहिए। Thon छल्ले कम से कम वांछित संकल्प अप करने के लिए दिखाई जानी चाहिए।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग कर प्राप्त एक cryoEM डाटासेट सीधे एक 3 डी पुनर्निर्माण उत्पन्न करने के क्रम में स्पा द्वारा संसाधित किया जा सकता है। यहां तक कि एक आदर्श नमूना के साथ, 3 डी पुनर्निर्माण की गुणवत्ता प्रदर्शन और मंदिर उपकरणों की विशेषताओं पर निर्भर करती है, और छवि प्रसंस्करण पर होगा। इन दोनों मोर्चों में, और हाल ही में विकसित प्रत्यक्ष इलेक्ट्रॉन डिटेक्टरों के लिए विशेष रूप से उल्लेख के साथ जारी रखा सुधार के साथ, संभावना अधिक लगातार परमाणु प्रस्ताव पर 3 डी पुनर्निर्माण प्राप्त यह कभी किया गया है की तुलना में करीब है।
The authors have nothing to disclose.
We thank the kind donations of AAV5 sample by Mavis Agbandje-McKenna and Antonette Bennett, and of TMV sample by Ruben Diaz. This work is supported by American Heart Association grant 14GRNT19660003 and VCU startup funds to MS.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Ethane | Airgas | 371745 | 99.99% purity very important, impurities can lead to high-contrast contaminants on the grid. CAUTION: flammable |
Liquid nitrogen | Airgas | 27135 | 99% purity. CAUTION: handling liquid nitrogen in a cold room poses a serious asphyxia hazard since nitrogen displaces oxygen without any warning signs. |
Dumont no. 5 Antimagnetic tweezers | Ted Pella | 5326 | |
Mica sheets, 1 x 4 cm | Ted Pella | 54 | |
Graphite rods, presharpened size 1/8” dia x 2 ¼” long tip 0.039” dia neck type | Electron Microscopy Sciences | 70220-45 | |
350 ml cryo-dewars | Pope | 8600 | |
Cu 400 mesh holey grids Quantifoil | Quantifoil | Q10525 | |
Cu 400 mesh holey grids C-Flat | Protochips | CF-1.2/1.3-4C | |
Glow discharge device | Electron Microscopy Sciences | Model E7620 | |
Turbo pumping station | Gatan | Model 655 | |
Carbon evaporator | Denton Vaccum | Model 502B | |
Freeze plunger | FEI | Vitrobot Mark IV | |
Image Processing software CTFFIND3/CTFTILT | http://grigoriefflab.janelia.org/ctf | ||
Image Processing software EMAN | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | ||
Image Processing software Spider | http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html | ||
Image Processing software Freealign | http://grigoriefflab.janelia.org/frealign | ||
3D visualization software Chimera | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | ||
Native Keyhole Limpet Hemocyanin | Biosyn |