프리온과 같은 증식은 최근 많은 신경 퇴행성 질환과 관련이 있는 것으로 부상했습니다. 이 프로토콜의 목표는 선충 C. elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 확산을 모니터링하고 프리온과 유사한 현상을 조사하는 방법을 설명하는 것입니다.
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이 논문에서
요약
단백질 응집체의
초록
프리온은 코딩 핵산이 없는 비전통적인 자가 증식 단백질 입자입니다. 이 proteinaceous seeds는 양성 세포 동형의 변환 및 복제를 위한 주형 역할을 합니다. 축적된 증거는 많은 단백질 응집체가 자체 증식 주형으로 작용하여 동족 단백질의 접힘을 손상시킬 수 있음을 시사합니다. 응집체는 특정 상황에서 기능할 수 있지만, 이 과정은 종종 세포 단백질 항상성(프로테오스타시스)의 파괴로 이어져 결국 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 근위축성 측삭 경화증(ALS) 또는 전염성 해면상뇌증(TSE)과 같은 치명적인 질병으로 이어집니다. 단백질 응집체의 프리온 전파 및 세포 간 확산의 정확한 메커니즘은 여전히 집중적인 연구 대상입니다. 이 지식을 더욱 발전시키기 위해, 최근에는 세포질 효모 프리온 단백질 Sup35의 프리온 도메인 발현을 위한 Caenorhabditis elegans의 새로운 후생동물 모델이 확립되었습니다. 이 프리온 모델은 살아있는 동물에서 형광 태그가 지정된 프리온 도메인을 직접 모니터링하고 유전적 접근을 용이하게 하기 때문에 몇 가지 이점을 제공합니다. 다음은 단백질 응집체의 프리온 유사 거동을 연구하고 예쁜꼬마선충을 사용하여 프리온 유도 독성의 변형자를 식별하는 방법에 대해 설명합니다.
서론
알츠하이머 병 (AD), 파킨슨 병 (PD), 근 위축성 측삭 경화증 (ALS) 및 전염성 해면상 뇌증 (TSEs)를 포함한 많은 신경 변성 질환, 응집하기 쉬운 단백질과 연관되어 있고, 따라서 집합 적 단백질 미스 폴딩 장애 (즉 PMD라고도 ). 그들은 모두 인간과 동물 (1)에 감염 될 수 있다는 점에서 TSEs 또는 프리온 질병은 PMD를 독특한 클래스를 구성한다. 분자 수준에서, 프리온은 모집 및 병리학 적 β-시트 풍부한 PRP 사우스 캐롤라이나 형태 2,3에 단량체 α 나선이 풍부한 호스트 인코딩 세포 PRP (PRP C)를 변환하여 복제합니다. 자체 전파 단백질 응집체는 포유 동물의 프리온 4,5으로 중요한 특성을 공유 곰팡이에서 확인되었다. 또한 프리온은 포유류 세포 간에서 이동할 수 있으며 6,7 나이브 세포를 감염.
즉 PMD의 OTH 동안어 TSEs는 전염성이없는 것보다, 그들은 프리온 질환 8,9와 공통 병원성 원칙을 공유 할 수 있습니다. PMD를 각각에 연결된 단백질 구조 또는 기능에 관련되지는 않지만, 그들은 결정화와 같은 과정을 통해 모든 형태의 집계는 ....
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프로토콜
1. 모니터링 세포 횡단는 생체 시간 경과 영상으로 프리온 같은 단백질의 확산
참고 : C. 성장 표준 방법에 조심스럽게 재배 온도 (47)를 제어에 따라 elegans의 야생형 (WT) (N2)와 유전자 변형 라인.
- C.의 유전자 변형 라인을 생성 엘레 단량체 적색 형광 단백질 (MRFP) 태그 프리온 같은 단백질을 표현. 미세 주입 (48)를 사용하는 방법을 보여줍니다 비디오를 시청. 이러한 염색체 외 라인을 통합하는 방법에 대한 자세한 내용과 방법에 대해서는 49을 참조하십시오.
- 계란은 표준 방법 (50)에 따라 누워 또는 표백에 의해 동기화 인구를 준비합니다.
- 달걀 누워에 의해 동기화
- 전송 10-20 임신하는 접시에 성인들이 1 알을 낳는하자 - 2 시간. 접시에서 어른을 제거하고 자손이 원하는 나이까지 성장 할 수 있습니다.
<표백에 의한 리> 동기화 - 임신하는 성인의 동기화 인구를 수집 및 알칼리 차아 염소산 용액 (250 mM의 NaOH를 ....
- 달걀 누워에 의해 동기화
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결과
생체 시간 경과 영상에 의해 프리온 같은 단백질의 확산 세포 간 모니터링
형질 전환 C. 프리온 도메인을 발현 간스 라인 형상의 프리온 단백질, 예를 들면 세포 간 전송 및 비 자율 세포 독성의 특정 양상의 분석에 특히 적합하다. 수의 형광 추적 동물의 투명성은 삶의 모든 단계에서 생체 내에서 단백질을 태그. 이것의 활용, 세포 형광 현미경을 사용하여 조직에서 프리온 같은 단백질의 움직임이 가시화된다. 63X 또는 100X / 1.4NA 기름 목적은 기공 구조를 해결하는 것이 필요하다. 중요한 것은, 프리온 도메인이 아마도 산성 소포 (40) 내에서 형광 계속 표시하기 위해, MRFP 태그되어야한다. 종종 태그로 사용되는 노란색 형광 단백질 (YFP), 난그것은 낮은 pH 환경 40,55 급냉되기 때문에 적합 아니다. 혼자 RFP 태그
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토론
여기에 설명 된 방법은 확산 예시 도와 같은 프리온 단백질의 조립 전지 자율 및 비 독성 세포 자율. 우리는 최근에 집계가 발생하기 쉬운 세포질 프리온 도메인이 자식 작용과 관련된 과정에 막 결합 소포로 흡수되는 것을 발견했다. 이러한 소체의 특정 서브 세트 내에서 세포 및 조직과 40 사이 프리온 도메인을 수송한다. 살아있는 동물에서의 움직임을 모니터링하는 키는 단백질 만 MRFP - 태그 단백질이 아마도 산성 소포에서 볼 수 있었기 때문에, MRFP 태그되어야한다는 것입니다. 동일한 방법을 사용하여, 우리는 현재와 같은 (ALS에 연결) 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 1 (SOD1), (PD에 연결) 알파 - 시누 클레인 또는 TAR의 DNA 결합 단백질과 같은 특정 질병 관련 단백질의 잠재적 인 프리온 같은 행동을 조사하고 있습니다 (ALS에 링크) (43) (TDP-43). 소포체 내의 세포 간 수송이 여러 다른 단백질에 의해 사용되는 것처럼 보이지만,이있을확산 허용 뉴 부가 경로.
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
원고에 대한 유용한 토론과 비판적 논평을 해준 Cindy Voisine과 Yoko Shibata에게 감사드립니다. 노스웨스턴 대학교의 HTAL(High Throughput Analysis Laboratory)과 BIF(Biological Imaging Facility)의 도움에 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, NIGMS, NIA, NINDS), 엘리슨 의학 재단(Ellison Medical Foundation), 대니얼 F. 앤 에이다 L. 라이스 재단(Daniel F. and Ada L. Rice Foundation)의 보조금으로 지원되었습니다. C.I.N.-K. Deutsche Forschungsgemeinschaft(KR 3726/1-1)의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 | |||
| 나노스피어 크기 표준 100 nm | ThermoScientific | 3100A | |
| Levamisole | Sigma | L-9756 | |
| IPTG | Sigma | 15502-10G | |
| Ahringer RNAi 라이브러리 | 출처 BioScience LifeSciences | http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/ | |
| 장비 | |||
| Sorvall Legend XTR 냉장 원심분리기, 120VAC | ThermoScientific | 75004521 | http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60 |
| 96 핀 리플리케이터 | 사이오노믹스 | http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/ | |
| HiGro 고용량, 인큐베이팅 쉐이커 | Digilab | http://www.digilabglobal.com/higro | |
| 멀티드롭 콤비 시약 디스펜서 | Titertrek | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm | |
| Biomek FX AP96 자동화 워크스테이션 | Beckman Coulter | http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm | |
| Innova44 shaker | 뉴 브런 즈윅 | http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04& action=제품& contentid=1& catalognode=83389 | |
| M205 FA | Leica | http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/ | |
| ORCA-R2 C10600-10B디지털 CCD 카메라 | Hamamatsu | http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html | |
| 회전 디스크 AF 컨포칼 현미경 | 라이카 | http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/ | |
| Falcon 4M60 카메라 | 텔레다인 달사 | http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/ | |
| 소프트웨어 | |||
| MetaMorph 현미경 자동화 & 이미지 분석 소프트웨어 | 분자 장치 | ||
| http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html Hamamatsu SimplePCI 이미지 분석 소프트웨어 | Meyer Instruments | ||
| http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm ImageJ | NIH | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html | |
| ImageJ | 용 wrMTrck 플러그인 | ||
| http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.htmlC. elegans 균주 | |||
| N2 (WT) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570 | |
| AM815 rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp] | 우리 실험실에서 구할 수 있는 | 모리모토 실험실 | |
| 폴딩 센서 및 응력 리포터 변형 |
참고문헌
- Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
- Jarrett, J. T., Lansbury, P. T. Seeding 'one-dimensional crystallization' of amyloid: a pathogenic mechanism in Alzheimer's disease and scrapie.....
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