पूरे सिगरेट के धुएं को Organotypic 3 डी ब्रोन्कियल और नाक ऊतक संस्कृति मॉडल की कई बार प्रदर्शन के प्रभाव आकलन
Summary
The aim of this protocol is to expose human organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream cigarette smoke (CS) at the air-liquid interface. The impact of CS on the tissues is then investigated using a cytochrome P450 activity assay, a cilia beating measurement, and a systems biology approach.
Abstract
Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer. To understand the underlying mechanisms of disease development, it would be important to examine the impact of CS exposure directly on lung tissues. However, this approach is difficult to implement in epidemiological studies because lung tissue sampling is complex and invasive. Alternatively, tissue culture models can facilitate the assessment of exposure impacts on the lung tissue. Submerged 2D cell cultures, such as normal human bronchial epithelial (NHBE) cell cultures, have traditionally been used for this purpose. However, they cannot be exposed directly to smoke in a similar manner to the in vivo exposure situation. Recently developed 3D tissue culture models better reflect the in vivo situation because they can be cultured at the air-liquid interface (ALI). Their basal sides are immersed in the culture medium; whereas, their apical sides are exposed to air. Moreover, organotypic tissue cultures that contain different type of cells, better represent the physiology of the tissue in vivo. In this work, the utilization of an in vitro exposure system to expose human organotypic bronchial and nasal tissue models to mainstream CS is demonstrated. Ciliary beating frequency and the activity of cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 were measured to assess functional impacts of CS on the tissues. Furthermore, to examine CS-induced alterations at the molecular level, gene expression profiles were generated from the tissues following exposure. A slight increase in CYP1A1/1B1 activity was observed in CS-exposed tissues compared with air-exposed tissues. A network-and transcriptomics-based systems biology approach was sufficiently robust to demonstrate CS-induced alterations of xenobiotic metabolism that were similar to those observed in the bronchial and nasal epithelial cells obtained from smokers.
Introduction
Lungs are directly and constantly exposed to inhaled air that may contain diverse toxicants such as pollutants and constituents of cigarette smoke (CS). Studying the impact of exposure to those toxicants on respiratory tissues is most informative when done in a manner that resembles in vivo exposure. Compared with the classical 2D immersed cell cultures (e.g., normal human bronchial epithelial cells (NHBE)), 3D organotypic tissue models better recapitulate the morphological, physiological, and molecular aspects of the human airway epithelium in vivo1,2: the 3D tissue models contain the diversity of the cell types observed in vivo, including differentiated epithelial cells, ciliated and non-ciliated cells, goblet cells, and basal cells. They have functional tight junctions and exhibit a mucociliary phenotype 1-3. Moreover, the cultures can be grown on a permeable porous membrane, in an air-liquid interface, allowing a direct exposure to aerosol at the apical side (whereas the basolateral side is immersed in culture medium) 3-5. Dvorak and colleagues reported that gene expression profiles of bronchial tissue models were similar to those obtained from human bronchial brushings 3. In addition, Mathis and colleagues showed that the responses of these tissue models to CS were similar to the differences observed between bronchial epithelial cells obtained from smokers and cells obtained from non-smokers 6. Finally, because the bronchial tissue models could be cultured for up to several months 4,5, they could potentially be used to examine the effects of long-term exposure of test items.
Cytotoxicity assessments are common parameters measured following chemical insults or to assess the toxicity of specific compounds or mixtures. For instance, membrane integrity can be measured by a luminescent assay and allows the measurement of a dose-dependent cytotoxic effect on the cell culture 7. However, to assess pathophysiological effects of compounds at subtoxic concentrations, other parameters should be measured. For example, tissue integrity determined using the transepithelial electrical resistance (TEER) assay ensures the functionality of tight junctions and monitors the disruption of the epithelial layer 8,9. Ciliary beating frequency also allows the measurement of CS-related effects on respiratory tissues. A normal beating frequency for the cilia lining bordering the upper and lower respiratory tract is important to protect against airway infections 10. Each of the ciliated columnar epithelial cells of the respiratory epithelium has 200-300 cilia beating at a particular frequency to eliminate infectious agents or inhaled particulate matter trapped in the mucus released by interspersed goblet cells 11. CS contains chemicals that may inhibit ciliary beating 12, leading to a reduced protection of the respiratory tract. This work shows that ciliary beating can be measured in organotypic tissue models. This approach allows assessment of whether epithelial cells exhibit their normal function in the organotypic tissue culture. CS also activates xenobiotic metabolism responses in the respiratory tract to metabolize tobacco smoke constituents 13. The activity of the phase I xenobiotic metabolism enzymes, CYP1A1 and CYP1B1, of the tissue models can be measured. Additionally, as previously reported, global gene expression can be measured in the organotypic bronchial tissue models 6,14,15. A transcriptomic data and network-based systems biology approach is leveraged to assess the impact of CS on xenobiotic metabolism 15.
The methodologies used to expose organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream CS using an in vitro exposure system and to measure the tissue responses to this exposure compared to fresh air exposure (control) are detailed here.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम दोहराया सीएस लोगों तक पहुंचाने के प्रभाव का आकलन करने के लिए मानव organotypic ब्रोन्कियल और नाक ऊतक मॉडल की प्रयोज्यता प्रदर्शन किया है। पशु परीक्षण के लिए एक विकल्प के रूप में, जोखिम प्रणालियों के एक नंबर (जैसे।, Vitrocell, Cultex, एलिस, आदि) के लिए इन विट्रो में एयरोसोल जोखिम की विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए विकसित किए गए। इन लोगों तक पहुंचाने के मॉड्यूल भी इस अध्ययन में आदि हवाई प्रदूषण, हवाई कणों, नैनोकणों के विषाक्तता के आकलन के लिए उपयोग किया जा सकता है, हम बड़े पैमाने पर प्रयोग के बीच कम परिवर्तनशीलता के लिए अनुमति देता है, एक साथ 48 विभिन्न नमूनों को समायोजित कर सकते हैं कि Vitrocell प्रणाली का इस्तेमाल किया उपचार। इन विट्रो में हर एयरोसोल लोगों तक पहुंचाने के लिए, टिशू कल्चर संदूषण का जोखिम जिसका शमन प्रयोगों के दौरान ऊतक संस्कृतियों का सावधानी से निपटने की मांग एक बड़ा जोखिम बना रहता है।
ई दौरान Microbalance पर वास्तविक समय में कण बयान मापनेxposure प्रयोग जोखिम प्रणाली से उत्पन्न सीएस खुराक उम्मीदों के अनुरूप रहे हैं कि निगरानी करने के लिए अनुमति देता है। सेटिंग-अप ऑनलाइन माप सही ढंग से लोगों तक पहुंचाने से पहले, जैसे, critial है क्योंकि Microbalance (2 सेमी) के क्षेत्रों के बीच अंतर का, इसके अतिरिक्त 0 करने के लिए पैमाने की स्थापना और, मापा कण बयान की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए टिशू कल्चर डालें (0.33 सेमी 2), हम संस्कृति डालने के क्षेत्र में अंतिम गणना समायोजित: Microbalance पर बयान के केवल 33% संस्कृति डालने में वास्तविक बयान दर्शाते हैं।
तंग-जंक्शन बाधा कार्यक्षमता का पता लगाने के लिए और उपकला परत के विघटन का आकलन करने के Teer का मापन हम यहां बताया जो लागू करने के लिए एक अपेक्षाकृत आसान प्रक्रिया है। ब्रोन्कियल और नाक ऊतक मॉडल बलगम उत्पादक interspersed जाम कोशिकाओं होते हैं क्योंकि हालांकि, शिखर धोने Teer meas के पहले प्रदर्शन करने की जरूरत हैurement। शिखर धोने के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि बलगम परत की उपस्थिति और सीएस जोखिम के प्रभाव के साथ interferring इसकी मोटाई कर सकते हैं पूर्वाग्रह Teer की माप की परिवर्तनशीलता,। इस धारणा Hilgendorf और Caco-2 कोशिकाओं की पारगम्यता बलगम उत्पादक जाम सेल लाइन HT29 23 के साथ सह संवर्धन से प्रभावित किया गया था, जिसमें उनके सहयोगियों द्वारा सूचित किया गया है के साथ समझौते में है। सही लोगों तक पहुंचाने से पहले शिखर धोने सीएस के लिए ऊतक प्रतिक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, क्योंकि बलगम, पूर्व Teer माप को धुल जाने की जरूरत है। इसलिए, माप तीन दिनों के प्रदर्शन से पहले प्रदर्शन किया, और लोगों तक पहुंचाने से पहले सही नहीं है।
हम गतिविधि केवल विनय सीएस की वृद्धि हुई थी, हालांकि CYP1A1 / CYP1B1 गतिविधि सीएस प्रदर्शन के बाद organotypic संस्कृति मॉडल से मापा जा सकता है कि पता चला है। इस कमजोर संकेत CYP1A1 / 1B1 सब्सट्रेट की एक लंबी ऊष्मायन से परिलक्षित किया जा सकता है (यानी।, Luciferin-CEE), उदाहरण के लिए के लिए24 घंटा (डेटा) नहीं दिखाया। वर्तमान काम में CYP गतिविधि माप की सीमाओं में से एक एंजाइम गतिविधि पर परिवर्तन को प्रभावित नहीं कर रहा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए CYP प्रोटीन के स्तर तक या भविष्य के अध्ययन के लिए ध्यान में रखा जा सकता है जो कोशिका गिनती, को सामान्य बनाने का अभाव है प्रोटीन के स्तर या सेल गिनती या तो परिवर्तन से।
हम सीएस लोगों तक पहुंचाने के नाक और ब्रोन्कियल ऊतक दोनों मॉडलों में पिटाई सिलिअरी हिचकते कि सूचना दी। इसी प्रकार टिप्पणियों विविध स्तनधारी और गैर स्तनधारी मॉडल 12 में किया गया। सिलिअरी, माप पिटाई ऊतकों एक समान तरीके से संभाला और इलाज कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए मध्यम परिवर्तन कार्यान्वित किया जाता है, तो यह सभी नमूनों के लिए लागू किया जाना चाहिए, उदाहरण के लिए महत्वपूर्ण है। Sutto और उनके सहयोगियों ने पीएच आवृत्ति 24 पिटाई स्तनधारी सिलिअरी प्रभावित है कि सूचना दी। इस प्रकार, विभिन्न compunds / मिश्रण, पीएच के साथ इलाज किया कोशिकाओं के बीच आवृत्तियों पिटाई की तुलना करते समयसमायोजन सिलिअरी पिटाई माप की परिवर्तनशीलता को कम से कम करने के लिए विचार किया जाना चाहिए। सिलिअरी पिटाई की आवृत्ति तापमान घटने के साथ बूंदों के रूप में इसके अलावा, माप आयोजित किया जाता है, जिस पर तापमान भी महत्वपूर्ण है। इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था तापमान, सीओ 2, और आर्द्रता नियंत्रण के साथ सुसज्जित इन परिवर्तनों, एक मंच टॉप इनक्यूबेटर के कारण परिवर्तनशीलता को कम से कम करने के लिए। इस के बावजूद, हम सीएस प्रदर्शन के बाद ब्रोन्कियल ऊतकों में आवृत्तियों की धड़कन सिलिअरी सिलिअरी पिटाई प्रदर्शन के बाद अत्यधिक परेशान सही है, सुझाव है कि अत्यधिक चर (यानी।, एक डालने में वृद्धि और अन्य डालने में कमी) थे कि मनाया। इसके विपरीत, हम नाक के ऊतकों की प्रतिक्रिया और अधिक संवेदनशील और सुसंगत है, सुझाव है कि सीएस प्रदर्शन के बाद नाक के ऊतकों में औसत दर्जे का सिलिअरी पिटाई आवृत्तियों के अभाव मनाया। यह नाक के ऊतकों के रूप में detoxify करने के लिए एक कम क्षमता दिखा रहा है कि पिछले एक प्रकाशन के साथ समझौते में हैश्वसनी 25 के साथ तुलना में।
अंत में, हम सीएस से अवगत कराया organotypic ब्रोन्कियल और नाक ऊतक मॉडल से की रूपरेखा जीन अभिव्यक्ति जीनोबायोटिक चयापचय पर सीएस का एक प्रभाव का प्रदर्शन कर सकता है कि पता चला है। पिछले एक प्रकाशन 15 में अधिक विस्तार से चर्चा के रूप में दिलचस्प है, सीएस के संपर्क में इन विट्रो मॉडल में मनाया organotypic ब्रोन्कियल में जीनोबायोटिक चयापचय में परिवर्तन और नाक धूम्रपान करने वालों में vivo में स्थिति की कि जैसे लगते हैं। जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए, रोबोट उपकरण का उपयोग कर एक उच्च throughput विश्लेषण संभव बनाता है। इसके अलावा, स्वचालित रोबोट से निपटने के आगे जीन एक्सप्रेशन परिणाम की स्थिरता और सटीकता बढ़ जाती है। बहरहाल, ऊतकों के नमूनों की तेजी संग्रह शाही सेना निकासी के दौरान शाही सेना गिरावट से बचने के लिए महत्वपूर्ण था। आरएनए प्रसंस्करण और यहाँ वर्णित transcriptomic दृष्टिकोण भी vivo में ऊतकों के नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों पांडुलिपि की उनकी समीक्षा के लिए मौरिस स्मिथ और Marja Talikka को धन्यवाद देना चाहूंगा।
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| MucilAir-human fibroblasts-bronchia | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/ | |
| MucilAir Culture Medium | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/ | |
| VITROCELL | VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany | http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R= | |
| 3R4F reference cigarette | University of Kentucky | http://www2.ca.uky.edu/refcig/ | |
| 30-port carousel smoking machine SM2000 | Philip Morris, Int. | ||
| CiliaMetrix camera and software | La Haute École de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland | ||
| Leica DMIL microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | ||
| LED light source | Titan Tool Supplies, Buffalo, NY | ||
| Chopstick Electrode STX-2 | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/ | |
| EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/ | |
| Luciferin Detection Reagent | |||
| MagNA Lyser Instrument | Roche | http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66 | |
| chloroform | Sigma-Aldrich | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion= | |
| QIAcube | Qiagen | 9001882 | |
| NanoDrop | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/ | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106 | |
| Affymetrix GeneChip High throughput 3’IVT Express Kit | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit | |
| Scanner 3000 7G | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G |
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