The aim of this protocol is to expose human organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream cigarette smoke (CS) at the air-liquid interface. The impact of CS on the tissues is then investigated using a cytochrome P450 activity assay, a cilia beating measurement, and a systems biology approach.
Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer. To understand the underlying mechanisms of disease development, it would be important to examine the impact of CS exposure directly on lung tissues. However, this approach is difficult to implement in epidemiological studies because lung tissue sampling is complex and invasive. Alternatively, tissue culture models can facilitate the assessment of exposure impacts on the lung tissue. Submerged 2D cell cultures, such as normal human bronchial epithelial (NHBE) cell cultures, have traditionally been used for this purpose. However, they cannot be exposed directly to smoke in a similar manner to the in vivo exposure situation. Recently developed 3D tissue culture models better reflect the in vivo situation because they can be cultured at the air-liquid interface (ALI). Their basal sides are immersed in the culture medium; whereas, their apical sides are exposed to air. Moreover, organotypic tissue cultures that contain different type of cells, better represent the physiology of the tissue in vivo. In this work, the utilization of an in vitro exposure system to expose human organotypic bronchial and nasal tissue models to mainstream CS is demonstrated. Ciliary beating frequency and the activity of cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 were measured to assess functional impacts of CS on the tissues. Furthermore, to examine CS-induced alterations at the molecular level, gene expression profiles were generated from the tissues following exposure. A slight increase in CYP1A1/1B1 activity was observed in CS-exposed tissues compared with air-exposed tissues. A network-and transcriptomics-based systems biology approach was sufficiently robust to demonstrate CS-induced alterations of xenobiotic metabolism that were similar to those observed in the bronchial and nasal epithelial cells obtained from smokers.
Lungs are directly and constantly exposed to inhaled air that may contain diverse toxicants such as pollutants and constituents of cigarette smoke (CS). Studying the impact of exposure to those toxicants on respiratory tissues is most informative when done in a manner that resembles in vivo exposure. Compared with the classical 2D immersed cell cultures (e.g., normal human bronchial epithelial cells (NHBE)), 3D organotypic tissue models better recapitulate the morphological, physiological, and molecular aspects of the human airway epithelium in vivo1,2: the 3D tissue models contain the diversity of the cell types observed in vivo, including differentiated epithelial cells, ciliated and non-ciliated cells, goblet cells, and basal cells. They have functional tight junctions and exhibit a mucociliary phenotype 1-3. Moreover, the cultures can be grown on a permeable porous membrane, in an air-liquid interface, allowing a direct exposure to aerosol at the apical side (whereas the basolateral side is immersed in culture medium) 3-5. Dvorak and colleagues reported that gene expression profiles of bronchial tissue models were similar to those obtained from human bronchial brushings 3. In addition, Mathis and colleagues showed that the responses of these tissue models to CS were similar to the differences observed between bronchial epithelial cells obtained from smokers and cells obtained from non-smokers 6. Finally, because the bronchial tissue models could be cultured for up to several months 4,5, they could potentially be used to examine the effects of long-term exposure of test items.
Cytotoxicity assessments are common parameters measured following chemical insults or to assess the toxicity of specific compounds or mixtures. For instance, membrane integrity can be measured by a luminescent assay and allows the measurement of a dose-dependent cytotoxic effect on the cell culture 7. However, to assess pathophysiological effects of compounds at subtoxic concentrations, other parameters should be measured. For example, tissue integrity determined using the transepithelial electrical resistance (TEER) assay ensures the functionality of tight junctions and monitors the disruption of the epithelial layer 8,9. Ciliary beating frequency also allows the measurement of CS-related effects on respiratory tissues. A normal beating frequency for the cilia lining bordering the upper and lower respiratory tract is important to protect against airway infections 10. Each of the ciliated columnar epithelial cells of the respiratory epithelium has 200-300 cilia beating at a particular frequency to eliminate infectious agents or inhaled particulate matter trapped in the mucus released by interspersed goblet cells 11. CS contains chemicals that may inhibit ciliary beating 12, leading to a reduced protection of the respiratory tract. This work shows that ciliary beating can be measured in organotypic tissue models. This approach allows assessment of whether epithelial cells exhibit their normal function in the organotypic tissue culture. CS also activates xenobiotic metabolism responses in the respiratory tract to metabolize tobacco smoke constituents 13. The activity of the phase I xenobiotic metabolism enzymes, CYP1A1 and CYP1B1, of the tissue models can be measured. Additionally, as previously reported, global gene expression can be measured in the organotypic bronchial tissue models 6,14,15. A transcriptomic data and network-based systems biology approach is leveraged to assess the impact of CS on xenobiotic metabolism 15.
The methodologies used to expose organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream CS using an in vitro exposure system and to measure the tissue responses to this exposure compared to fresh air exposure (control) are detailed here.
Qui, abbiamo dimostrato l'applicabilità bronchiale organotipica umana e modelli tessuti nasali per valutare l'impatto di esposizione ripetuta CS. In alternativa alla sperimentazione animale, un certo numero di sistemi di esposizione sono stati sviluppati per le valutazioni tossicologiche dell'esposizione aerosol in vitro (ad es., Vitrocell, Cultex, ALICE, etc.). Questi moduli di esposizione possono anche essere utilizzati per una valutazione tossicologica di inquinanti nell'aria, particelle sospese nell'aria, nanoparticelle, ecc In questo studio, abbiamo utilizzato il sistema Vitrocell che può ospitare fino a 48 campioni diversi contemporaneamente, consentendo sperimentazioni su scala più ampia e bassa variabilità tra i trattamenti. Per ogni esposizione aerosol in vitro, il rischio di contaminazione coltura tissutale rimane un rischio maggiore il cui mitigazione richiede un accurato trattamento delle colture di tessuto durante gli esperimenti.
Misurazione deposito di particelle in tempo reale sul microbilancia durante la eesperimento Xposure permette di monitorare che le dosi CS generati dal sistema di esposizione sono conformi alle aspettative. Per garantire la precisione della deposizione di particelle misurata, messa a punto la misura in linea correttamente prima dell'esposizione è critial, ad esempio, la creazione di scala a 0. Inoltre, a causa della differenza tra le aree del microbilancia (cm 2) e la inserto coltura tissutale (0,33 cm 2), abbiamo regolato il calcolo finale alla zona dell'inserto coltura: solo il 33% della deposizione sul microbilancia riflette la deposizione effettiva nell'inserto cultura.
Misurazione di TEER accertare funzionalità barriera a tenuta giunzione e per valutare interruzione dello strato epiteliale è una procedura relativamente facile da implementare, che abbiamo riportato qui. Tuttavia, poiché i modelli di tessuto bronchiali e nasali contengono cellule calice intervallati producono muco, lavaggio apicale deve essere eseguita prima delle meas Teermi-. Il lavaggio apicale è critica perché la presenza dello strato di muco e la variabilità del suo spessore può influenzare la misura della TEER, interferire con l'impatto dell'esposizione CS. Questa nozione è in accordo con quanto riportato da Hilgendorf e colleghi, in cui la permeabilità delle cellule Caco-2 è stata influenzata dalla co-coltura con la linea cellulare calice-muco produzione HT29 23. Il muco ha bisogno di essere lavato via prima della misurazione TEER, perché il lavaggio apicale destra prima dell'esposizione può interferire con le risposte del tessuto a CS. Pertanto, la misura viene eseguita tre giorni prima dell'esposizione, e non appena prima dell'esposizione.
Abbiamo dimostrato che l'attività CYP1A1 / CYP1B1 potrebbe essere misurata dai modelli culturali organotipica a seguito di esposizione CS, anche se l'attività è stata solo modesta aumentato del CS. Questo segnale debole può essere amplificato da una incubazione più lungo del substrato CYP1A1 / 1B1 (es., Luciferina-CEE), ad esempio per24 hr (dati non mostrati). Uno dei limiti della misurazione dell'attività CYP nel presente lavoro è l'assenza di normalizzazione al livello proteico CYP o per il conteggio delle cellule, che potrebbe essere preso in considerazione per studi futuri per garantire che l'alterazione sull'attività enzimatica non è influenzata dall'alterazione sia del livello di proteina o la conta delle cellule.
Abbiamo segnalato che l'esposizione CS inibito l'ciliare battendo sia nel nasale e modelli di tessuto bronchiale. Osservazioni analoghe sono state fatte in diversi modelli di mammiferi e non mammiferi 12. Per ciliare battendo misurazione, assicurando che i tessuti sono trattati e trattati in modo analogo è critica, per esempio se è implementata medio cambiamento, dovrebbe essere applicata per tutti i campioni. Sutto e colleghi hanno riferito che il pH colpito il ciliare mammiferi battendo frequenza 24. Così, quando si confrontano battendo frequenze tra cellule trattate con diverse compunds / miscele, pHregolazione dovrebbe essere considerata per minimizzare la variabilità della misurazione battito ciliare. Inoltre, la temperatura alla quale la misura viene condotta è anche critica come la frequenza del battito ciliare scende al diminuire della temperatura. Per ridurre al minimo la variabilità a causa di questi cambiamenti, un incubatore fase-top, attrezzate con la temperatura, CO 2, e il controllo dell'umidità è stato utilizzato in questo studio. Nonostante questo, abbiamo osservato che il ciliare battendo frequenze nei tessuti bronchiali dopo l'esposizione CS erano molto variabile (es., Di aumentare in un inserto e diminuire nell'altro inserto), suggerendo che il battito ciliare è giusto altamente disturbato dopo l'esposizione. Al contrario, abbiamo osservato l'assenza di frequenze misurabili battito ciliare nel tessuto nasale dopo esposizione CS, suggerendo che la risposta del tessuto nasale è più sensibile e coerente. Ciò è in accordo con una precedente pubblicazione dimostrano che il tessuto nasale ha una capacità inferiore a disintossicarsi comerispetto bronco 25.
Infine, abbiamo dimostrato che l'espressione del gene profiling dal bronchiale organotipica e modelli tessuti nasali esposto al CS potrebbe dimostrare un impatto di CS sul metabolismo xenobiotico. È interessante notare che l'alterazione osservata nel metabolismo xenobiotico nel bronchiale organotipica nasale modelli in vitro esposto a CS assomigliano che la situazione in vivo nei fumatori come discusso in maggior dettaglio in una pubblicazione precedente 15. Per le analisi di espressione genica, utilizzando lo strumento robotico rende possibile l'analisi ad alta produttività. Inoltre, la manipolazione robotizzata automatica aumenta ulteriormente la coerenza e la precisione dei risultati di espressione genica. Tuttavia, veloce raccolta dei campioni di tessuto è stato fondamentale per evitare la degradazione dell'RNA durante l'estrazione di RNA. Il trattamento RNA e approcci trascrittomiche qui descritte possono anche essere applicati a campioni di tessuto in vivo.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare Maurice Smith e Marja Talikka per la loro revisione del manoscritto.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MucilAir-human fibroblasts-bronchia | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/ | |
MucilAir Culture Medium | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/ | |
VITROCELL | VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany | http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R= | |
3R4F reference cigarette | University of Kentucky | http://www2.ca.uky.edu/refcig/ | |
30-port carousel smoking machine SM2000 | Philip Morris, Int. | ||
CiliaMetrix camera and software | La Haute École de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland | ||
Leica DMIL microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | ||
LED light source | Titan Tool Supplies, Buffalo, NY | ||
Chopstick Electrode STX-2 | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/ | |
EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/ | |
Luciferin Detection Reagent | |||
MagNA Lyser Instrument | Roche | http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66 | |
chloroform | Sigma-Aldrich | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion= | |
QIAcube | Qiagen | 9001882 | |
NanoDrop | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/ | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106 | |
Affymetrix GeneChip High throughput 3’IVT Express Kit | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit | |
Scanner 3000 7G | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G |