The aim of this protocol is to expose human organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream cigarette smoke (CS) at the air-liquid interface. The impact of CS on the tissues is then investigated using a cytochrome P450 activity assay, a cilia beating measurement, and a systems biology approach.
Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease or lung cancer. To understand the underlying mechanisms of disease development, it would be important to examine the impact of CS exposure directly on lung tissues. However, this approach is difficult to implement in epidemiological studies because lung tissue sampling is complex and invasive. Alternatively, tissue culture models can facilitate the assessment of exposure impacts on the lung tissue. Submerged 2D cell cultures, such as normal human bronchial epithelial (NHBE) cell cultures, have traditionally been used for this purpose. However, they cannot be exposed directly to smoke in a similar manner to the in vivo exposure situation. Recently developed 3D tissue culture models better reflect the in vivo situation because they can be cultured at the air-liquid interface (ALI). Their basal sides are immersed in the culture medium; whereas, their apical sides are exposed to air. Moreover, organotypic tissue cultures that contain different type of cells, better represent the physiology of the tissue in vivo. In this work, the utilization of an in vitro exposure system to expose human organotypic bronchial and nasal tissue models to mainstream CS is demonstrated. Ciliary beating frequency and the activity of cytochrome P450s (CYP) 1A1/1B1 were measured to assess functional impacts of CS on the tissues. Furthermore, to examine CS-induced alterations at the molecular level, gene expression profiles were generated from the tissues following exposure. A slight increase in CYP1A1/1B1 activity was observed in CS-exposed tissues compared with air-exposed tissues. A network-and transcriptomics-based systems biology approach was sufficiently robust to demonstrate CS-induced alterations of xenobiotic metabolism that were similar to those observed in the bronchial and nasal epithelial cells obtained from smokers.
Lungs are directly and constantly exposed to inhaled air that may contain diverse toxicants such as pollutants and constituents of cigarette smoke (CS). Studying the impact of exposure to those toxicants on respiratory tissues is most informative when done in a manner that resembles in vivo exposure. Compared with the classical 2D immersed cell cultures (e.g., normal human bronchial epithelial cells (NHBE)), 3D organotypic tissue models better recapitulate the morphological, physiological, and molecular aspects of the human airway epithelium in vivo1,2: the 3D tissue models contain the diversity of the cell types observed in vivo, including differentiated epithelial cells, ciliated and non-ciliated cells, goblet cells, and basal cells. They have functional tight junctions and exhibit a mucociliary phenotype 1-3. Moreover, the cultures can be grown on a permeable porous membrane, in an air-liquid interface, allowing a direct exposure to aerosol at the apical side (whereas the basolateral side is immersed in culture medium) 3-5. Dvorak and colleagues reported that gene expression profiles of bronchial tissue models were similar to those obtained from human bronchial brushings 3. In addition, Mathis and colleagues showed that the responses of these tissue models to CS were similar to the differences observed between bronchial epithelial cells obtained from smokers and cells obtained from non-smokers 6. Finally, because the bronchial tissue models could be cultured for up to several months 4,5, they could potentially be used to examine the effects of long-term exposure of test items.
Cytotoxicity assessments are common parameters measured following chemical insults or to assess the toxicity of specific compounds or mixtures. For instance, membrane integrity can be measured by a luminescent assay and allows the measurement of a dose-dependent cytotoxic effect on the cell culture 7. However, to assess pathophysiological effects of compounds at subtoxic concentrations, other parameters should be measured. For example, tissue integrity determined using the transepithelial electrical resistance (TEER) assay ensures the functionality of tight junctions and monitors the disruption of the epithelial layer 8,9. Ciliary beating frequency also allows the measurement of CS-related effects on respiratory tissues. A normal beating frequency for the cilia lining bordering the upper and lower respiratory tract is important to protect against airway infections 10. Each of the ciliated columnar epithelial cells of the respiratory epithelium has 200-300 cilia beating at a particular frequency to eliminate infectious agents or inhaled particulate matter trapped in the mucus released by interspersed goblet cells 11. CS contains chemicals that may inhibit ciliary beating 12, leading to a reduced protection of the respiratory tract. This work shows that ciliary beating can be measured in organotypic tissue models. This approach allows assessment of whether epithelial cells exhibit their normal function in the organotypic tissue culture. CS also activates xenobiotic metabolism responses in the respiratory tract to metabolize tobacco smoke constituents 13. The activity of the phase I xenobiotic metabolism enzymes, CYP1A1 and CYP1B1, of the tissue models can be measured. Additionally, as previously reported, global gene expression can be measured in the organotypic bronchial tissue models 6,14,15. A transcriptomic data and network-based systems biology approach is leveraged to assess the impact of CS on xenobiotic metabolism 15.
The methodologies used to expose organotypic 3D bronchial and nasal tissue models to mainstream CS using an in vitro exposure system and to measure the tissue responses to this exposure compared to fresh air exposure (control) are detailed here.
Aqui, nós têm demonstrado a aplicabilidade de modelos de tecido nasal e bronquial organotípicas humanas para avaliar o impacto da exposição repetida CS. Como uma alternativa para testes em animais, foram desenvolvidas uma série de sistemas de exposição para as avaliações toxicológicas de exposição ao aerossol in vitro (eg., Vitrocell, Cultex, ALICE, etc.). Estes módulos de exposição também pode ser utilizado para uma avaliação toxicológica dos poluentes transportados pelo ar, partículas em suspensão, nanopartículas, etc. Neste estudo, foi utilizado o sistema Vitrocell que pode acomodar até 48 amostras diferentes simultaneamente, permitindo experiências de maior escala e menor variabilidade entre tratamentos. Para cada exposição ao aerossol in vitro, o risco de contaminação da cultura de tecido continua a ser um grande risco cuja atenuação exige uma manipulação cuidadosa das culturas de tecido durante todo o experimento.
Medindo a deposição de partículas em tempo real sobre o microbalança de e durante oXposure experimento permite monitorar se as doses CS geradas a partir do sistema de exposição estão em conformidade com as expectativas. Para garantir a precisão da deposição de partículas medida, estabelecendo-se a medição on-line corretamente antes da exposição é critial, por exemplo, a criação de escala a 0. Além disso, por causa da diferença entre as áreas da microbalança (cm 2) e o inserção de cultura de tecido (0,33 cm 2), foi ajustado o cálculo final para a área da inserção de cultura: apenas 33% da deposição na microbalança reflectir a deposição efectiva na lâmina de cultura.
Medição da TEER verificar funcionalidade barreira tight-junção e avaliar rompimento da camada epitelial é um procedimento relativamente fácil de implementar, o que nós informamos aqui. No entanto, porque os modelos de tecido brônquico e nasal contém células caliciformes intercaladas produtoras de muco, lavagem apical precisa ser realizada antes dos meas TEERmedi-. A lavagem apical é crítica, pois a presença da camada de muco e a variabilidade da sua espessura pode enviesar a medição de TEER, ou seja, interferindo com o impacto da exposição CS. Esta noção está de acordo com o que foi relatado por Hilgendorf e colegas, em que a permeabilidade de células Caco-2 foi afectada pela co-cultura com a linha de células caliciformes produtoras de muco HT29 23. O muco precisa ser lavado antes da medição TEER, porque lavagem apical à direita antes da exposição pode interferir com as respostas teciduais para CS. Por conseguinte, a medição é realizada três dias antes da exposição, e não antes da exposição à direita.
Nós mostramos que a atividade CYP1A1 / CYP1B1 pode ser medida a partir dos modelos de cultura organotypic seguintes exposição CS embora a atividade foi apenas modestamente aumentou CS. Este sinal fraco pode ser amplificado por um mais longo de incubação do substrato de CYP1A1 / 1B1 (ie., Luciferina-CEE), por exemplo, para24 horas (dados não mostrados). Uma das limitações da medição da actividade CYP no presente trabalho é a ausência de normalização ao nível da proteína CYP ou para a contagem de células, o que pode ser tomado em conta para futuros estudos para assegurar que a alteração na actividade da enzima não é influenciada pela alteração do nível ou da proteína ou a contagem de células.
Nós relataram que a exposição CS inibiu o batimento ciliar, tanto na modelos de tecido dos brônquios e nasal. Observações semelhantes foram feitas em diversos mamíferos e não mamíferos modelos 12. Para ciliar batendo medição, assegurando que os tecidos são tratados e tratados de um modo semelhante é crítico, por exemplo, se a mudança meio é realizada, deverá ser aplicado para todas as amostras. Sutto e colegas relataram que afetou o pH ciliar mamíferos batendo frequência 24. Assim, quando se comparam batendo frequências entre as células tratadas com diferentes misturas / compunds, pHDeve ser considerado ajuste para minimizar a variabilidade da medição da batimentos ciliares. Além disso, a temperatura na qual a medição é conduzida também é crítico que a frequência de batimento ciliar gotas com a diminuição da temperatura. Para minimizar a variabilidade devido a essas mudanças, uma incubadora fase de topo, equipados com a temperatura, CO2, e para controlo de humidade foi usada neste estudo. Apesar disso, observou-se que o batimento ciliar freqüências nos tecidos bronquiais após a exposição CS foram altamente variável (ie., Aumentar em um insert e diminuir na outra inserção), sugerindo que o batimento ciliar é certo altamente perturbado após a exposição. Em contraste, observou-se a ausência de frequências de batimento ciliar mensuráveis no tecido nasal após exposição CS, sugerindo que a resposta do tecido nasal é mais sensível e mais consistente. Isto está de acordo com uma publicação anterior mostrando que o tecido nasal tem uma menor capacidade de desintoxicar comoem comparação com o brônquio 25.
Finalmente, mostrou-se que a expressão do gene a partir do perfil de modelos de tecido nasal e bronquial organotípicas expostos a CS poderiam demonstrar um impacto de CS no metabolismo xenobiótico. Curiosamente, a alteração observada no metabolismo xenobiótico no brônquica organotípicas e nasal em modelos in vitro expostos a CS assemelhar-se à situação in vivo em fumadores como discutido em maior detalhe numa publicação anterior 15. Para análises de expressão de genes, utilizando o instrumento robotizado faz uma análise de alto rendimento possível. Além disso, a manipulação robótica automática aumenta ainda mais a consistência ea precisão dos resultados de expressão gênica. No entanto, a recolha rápida das amostras de tecido foi fundamental para evitar a degradação de RNA durante a extracção de ARN. O processamento de RNA e abordagens transcriptómico descritos aqui também podem ser aplicados a amostras de tecido in vivo.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a Maurice Smith e Marja Talikka para a sua revisão do manuscrito.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MucilAir-human fibroblasts-bronchia | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/ | |
MucilAir Culture Medium | Epithelix Sárl, Geneva, Switzerland | http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/ | |
VITROCELL | VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Germany | http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R= | |
3R4F reference cigarette | University of Kentucky | http://www2.ca.uky.edu/refcig/ | |
30-port carousel smoking machine SM2000 | Philip Morris, Int. | ||
CiliaMetrix camera and software | La Haute École de Gestion (HESGE), Geneva, Switzlerland | ||
Leica DMIL microscope | Leica, Heerbrugg, Switzerland | ||
LED light source | Titan Tool Supplies, Buffalo, NY | ||
Chopstick Electrode STX-2 | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/ | |
EVOMXTM Epithelial Voltohmmeter | World Precision Instruments | http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/ | |
Luciferin Detection Reagent | |||
MagNA Lyser Instrument | Roche | http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66 | |
chloroform | Sigma-Aldrich | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion= | |
QIAcube | Qiagen | 9001882 | |
NanoDrop | Thermo Scientific | http://www.nanodrop.com/ | |
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106 | |
Affymetrix GeneChip High throughput 3’IVT Express Kit | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit | |
Scanner 3000 7G | Affymetrix | http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G |