Abstract
Cambiamenti di lunga durata nel cervello o 'plasticità cerebrale' alla base di un comportamento adattivo e riparazione del cervello a seguito di malattia o infortunio. Inoltre, le interazioni con l'ambiente possono indurre la plasticità cerebrale. Sempre più spesso, la ricerca sta cercando di identificare quali ambienti stimolare la plasticità del cervello favorevole per il trattamento del cervello e disturbi comportamentali. Due manipolazioni ambientali vengono descritti che aumentare o diminuire il numero di tirosina idrossilasi immunopositive (TH +, l'enzima limitante della dopamina (DA) sintesi), i neuroni del mesencefalo topo adulto. Il primo comprende accoppiamento topi maschi e femmine insieme ininterrottamente per 1 settimana, che aumenta TH + mesencefalo neuroni di circa il 12% nei maschi, ma diminuisce TH + mesencefalo neuroni di circa il 12% nelle femmine. Il secondo comprende topi abitative ininterrottamente per 2 settimane in "ambienti arricchiti» (EE) contenenti ruote corsa, giocattoli, corde, materiale di nidificazione, ecc, che increases TH + mesencefalo neuroni di circa il 14% nei maschi. Inoltre, un protocollo è descritto per infusione contemporaneamente farmaci direttamente nel mesencefalo durante queste manipolazioni ambientali per identificare i meccanismi alla base della plasticità cerebrale ambientale indotta. Ad esempio, EE-induzione di più TH + mesencefalo neuroni è abolito dal blocco concomitante di ingresso sinaptica sui neuroni del mesencefalo. Insieme, questi dati indicano che le informazioni circa l'ambiente viene trasmessa tramite l'ingresso sinaptica di neuroni mesencefalo per attivare o disattivare l'espressione di geni 'DA'. Così, la stimolazione ambientale adeguata, o drug targeting dei meccanismi alla base, potrebbe essere utile per il trattamento di disturbi cerebrali e comportamentali connessi con gli squilibri in mesencefalo DA (ad esempio il morbo di Parkinson, deficit di attenzione e iperattività, schizofrenia, e la tossicodipendenza).
Introduction
DArgic segnalazione dai neuroni nell'area ventrale tegmentale (VTA) e la substantia nigra pars compacta (SNC) del mesencefalo è pensato per essere importante per i comportamenti cognitivi, emotivi e motori ricompensa motivati. Tuttavia, troppo o troppo poco di segnalazione DA mesencefalo provoca molti sintomi invalidanti in una serie di disturbi neurologici (ad esempio il morbo di Parkinson, deficit di attenzione e iperattività, schizofrenia, e tossicodipendenza). I farmaci che aumentano o diminuiscono DA segnalazione alleviare questi sintomi, ma producono anche effetti collaterali riconducibili alla segnalazione disregolato ed effetti off-target. Efficacia Drug declina anche nel tempo a causa di reazioni compensatorie del cervello. La sfida è quindi di ripristinare la normale segnalazione DA mesencefalo in modo più mirato e fisiologico, e un approccio preferito è aumentando o diminuendo il numero di mesencefalo neuroni DA.
La prova si è accumulato per SEVdecenni rale che l'espressione di geni e proteine coinvolte nel metabolismo e il traffico DA e altre catecolamine in cellule adulte mature è modificabile (recensito in 1). Nel mesencefalo, il numero di tirosina idrossilasi immunopositive (TH +, l'enzima limitante nella sintesi) DA neuroni diminuisce quindi aumenta in seguito alla somministrazione neurotossina 2,3, mentre il numero di TH immunonegative (TH) neuroni mostra l'andamento opposto (vale a dire gli aumenti poi diminuisce 3). Questo è coerente con la perdita poi guadagno del 'DA fenotipo' da alcune cellule. Il numero di neuroni TH + e TH SNC è stato anche dimostrato di modificare in direzioni uguali ma opposti seguente vari trattamenti che alterano l'attività elettrica di queste cellule 4,5. Ad esempio, l'infusione della piccola conduttanza, potassio calcio-attivata (SK) canale antagonista Apamina nel mesencefalo per 2 settimane diminuisce il numero di TH + e aumenta (dello stesso importo) il number di TH SNc neuroni 4,5. Al contrario, l'infusione di SK agonisti canale 1-EBIO aumenta il numero di TH + e diminuisce (dello stesso importo) il numero di neuroni TH SnC 4,5. Modifiche simili sono state osservate in seguito a una serie di trattamenti mirati SNc attività neuronale, tra cui alcuni che mira ingressi afferenti 4. Questa apparente regolazione del numero di neuroni SNc DArgic per attività neuronale e input afferenti solleva la possibilità che l'ambiente o il comportamento possono influenzare il numero di neuroni SnC. Infatti topi adulti esposti ad ambienti differenti hanno più o meno mesencefalo (SNC e VTA) TH + neuroni, e almeno alcuni di questi cambiamenti ambientali indotti sono soppressi dal blocco concomitante di ingresso sinaptica nel mesencefalo 6. Gli obiettivi di questa comunicazione sono: (1) fornire ulteriori dettagli su come implementare le nostre manipolazioni ambientali e infusi di droga; e (2) fornire ulteriori dati a sostegno della nostra tesi che la postanvironment regola il numero di mesencefalo neuroni DA, tramite l'ingresso afferente.
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Protocol
NOTA: Tutte le procedure sperimentali su animali sono stati approvati dall'Istituto Florey di Neuroscienze e Salute mentale Comitato etico degli animali e sono conformi alle Australia National Health e Medical Research Council ha pubblicato il codice di condotta per la cura e l'uso di animali a fini scientifici (7 ° edizione, 2004).
1. manipolazioni ambientali
- Genere Pairing
- Utilizzare sessualmente maturi (> 8 settimane di età), di sesso maschile di pari età e topi femmina.
NOTA: Noi di solito utilizzare C57BL / 6 topi, ma abbiamo avuto gli stessi risultati utilizzando topi svizzero in questo protocollo. Usiamo tipicamente n = 8 maschi e n = 8 femmine per ogni esperimento, diviso in n = 2 coppie maschio-maschio (n = 4 maschi), n = 2 coppie femmina-femmina (n = 4 femmine), e n = 4 coppie maschio-femmina (n = 4 maschi e n = 4 femmine). - All'arrivo nella struttura detenzione degli animali, il gruppo-casa i topi di genere per> 3 giorni di tempo per acclimatarsi. Qui e througHout l'abbinamento genere, mantenere stimoli ambientali estranei (ad esempio la temperatura ambiente, la luce: il ciclo scuro, cibo, acqua, gestione e pulizia) costante o distribuire equamente a tutti i topi.
- Assegna in modo casuale ogni mouse a una coppia maschio-maschio, un paio femmina-femmina, o un paio maschio-femmina. Mettere ogni coppia in una gabbia pulita in isolamento (2 topi / gabbia) con ad libitum l'accesso al cibo e all'acqua, e semplicemente alloggiare in questo modo continuo per 7 giorni.
NOTA: routine zootecnia è OK in questo periodo, ma deve essere distribuito equamente a tutti i topi. Fare attenzione ad evitare l'accoppiamento di fratellini maschili e femminili.
- Utilizzare sessualmente maturi (> 8 settimane di età), di sesso maschile di pari età e topi femmina.
- Arricchimento ambientale
- Utilizzare sessualmente maturi (> 8 settimane di età), maschio o femmina topi di pari età.
NOTA: Usiamo tipicamente n = 18 topi per ogni esperimento, divisi in gruppo n = 6 / trattamento. - All'arrivo nella struttura detenzione animale tenerli ospitato gruppo ospitato in serie identiche (SH) (ad esempio, (ad esempio la temperatura ambiente, la luce: il ciclo scuro, cibo, acqua, gestione e pulizia) costante o distribuire equamente a tutti i topi.
- Per iniziare l'arricchimento ambientale, assegnare casualmente ogni mouse a uno dei 3 gruppi: SH; ruote in esecuzione (RW), o l'ambiente arricchito (EE) e porre ogni gruppo di topi insieme in una gabbia pulita identico ad libitum accesso al cibo e all'acqua.
NOTA: Qui, gabbie più grandi-ratto in possesso di tutti i gruppi, di 27 cm di larghezza, 42 cm e 16 cm di profondità sono stati utilizzati.- Inoltre, fornire le seguenti condizioni ambientali per ciascun gruppo: SH che comprende solo cucciolata (pellet di carta o segatura) al piano; RW comprendente SH più 2 in esecuzione ruote; EE comprendente RW più giocattoli (corde, scale, tunnel, e oggetti, quali panini e pezzi di carta velina tovagliolo di carta vuoto) con la quale a explore, giocare, arrampicarsi, nascondersi, e nido.
- Loro casa in questo modo continuo per 14 giorni.
NOTA: routine zootecnia è OK in questo periodo, ma deve essere distribuito equamente a tutti i topi.
- Oggetto topi EE a ulteriori 'super-arricchimento' (SE) per metterli insieme in una gabbia più grande contenente nuovi giocattoli per 1 ora / giorno (stessa ora ogni giorno), 5 giorni / settimana.
NOTA: Qui, di larghezza di 46 centimetri, lunga 69 centimetri, e 40 cm di profondità vasca di plastica è stato utilizzato.- Mantenere novità presentando un diverso insieme di giocattoli ogni sessione. Giocattoli puliti che devono essere ri-presentati a topi con acqua e sapone e l'80% di etanolo per rimuovere i profumi.
- Dopo ogni sessione di SE, restituire i topi alla loro gabbia EE. Maniglia SH e RW topi gli stessi topi SE (ad eccezione di SE stessa) in tutto questo periodo (ad esempio, rimuovere e ritornano ogni SH e RW del mouse da e verso la sua gabbia).
- Utilizzare sessualmente maturi (> 8 settimane di età), maschio o femmina topi di pari età.
- Preparazione
- Utilizzare pompe osmotiche sterili e kit di infusione del cervello, che sono disponibili in commercio. Il giorno prima dell'impianto, utilizzando una tecnica asettica, primi gli impianti di riempimento ogni pompa, tubo di collegamento e la cannula con la soluzione di droga o di un veicolo sterile (come descritto nelle istruzioni fornite con le pompe). Collegarli insieme e incubare in soluzione fisiologica sterile notte a 37 ° C. Incubare impianti alla droga e veicoli pieni separatamente per evitare la contaminazione incrociata.
- Chirurgia.
NOTA: A seconda del paese dello sperimentatore, particolari autorizzazioni o di quote di sperimentazione animale sono tenuti a perseguire questo tipo di chirurgia e sperimentazioni post-operatorie.- Sterilizzare tutti gli apparecchi chirurgici e utilizzare condizioni asettiche. Anestetizzare un mouse (ad esempio utilizzando 1-2% isofluorane in aria) e collocarlo in un sterecastelletto otaxic. Controllare la profondità dell'anestesia durante tutta la procedura e somministrare un'ulteriore anestesia, se necessario (ad esempio, l'assenza di recesso arto per nociva zampa pizzico è indicativo di anestesia adeguata). Assicurarsi che gli occhi sono protetti da disseccamento da pomata lubrificante occhio, e che la temperatura corporea del mouse rimane normale per tutta la procedura.
- Effettuare una incisione mediana attraverso la pelle partendo da tra gli occhi e Finitura 2 cm posteriormente al bordo posteriore del cranio. Blunt sezionare la pelle dalla fascia sottostante lungo la schiena del mouse per creare una sottocutanea 'tasca' grande abbastanza per adattarsi comodamente la pompa e il tubo di collegamento volta la cannula viene impiantato (il tubo di collegamento non deve essere piegato al termine). Raschiare cancellare la fascia da oltre all'aspetto dorsale del cranio.
- L'utilizzo di un diametro di bava dentale approssimativamente di 1,5 mm, drill-down nel cranio al stereotassico appropriata coordinate uino un sottile strato flessibile di resti ossei. Peel questo strato di distanza utilizzando una pinza sottile (questo evita di danneggiare la sottostante dura madre e il cervello con la bava dentale). Assicurarsi che il cranio è pulito di eventuali frammenti di sangue e ossa, e che non c'è più il sanguinamento.
- Con la cannula tenuto da un supporto cannule, posizionare la pompa e tubo di collegamento in 'tasca' sottocutanea sovrastante schiena del mouse. Successivamente, posizionare la punta della cannula in opportuni coordinate stereotassica e sulla superficie del cervello. Abbassare con cautela la cannula nel cervello, ma smettere di circa 1 millimetro brevi della profondità richiesta.
NOTA: La profondità residua sarà negoziato dopo l'applicazione del primo strato di acrilico dentale. - Verificare nuovamente la superficie del cranio è pulito ed asciutto, quindi preparare un piccolo volume di acrilico dentale e utilizzare uno stuzzicadenti per lisciare sull'intera area esposta del cranio, compreso nel bava foro attraverso il cranio intorno the cannula. Prima l'acrilico indurisce, abbassare la cannula punta la profondità residua nel bersaglio.
- Preparare un'altra piccolo volume di acrilico dentale e questo strato sul primo, così come il supporto plastico bianco per la cannula, per fissare la cannula in posizione. Ripetere con ulteriori strati di acrilico, se necessario.
- Una volta che l'acrilico è indurito, rimuovere con attenzione il supporto cannule e tagliare la plastica scheda cannula rimovibile bianco con una lama di bisturi riscaldata con una fiamma butano. Infine, suturare la pelle chiusa sull'intero impianto.
- Il trattamento post-chirurgico di animali
- Applicare pomata antisettica ai margini della pelle, e somministrare un antinfiammatorio al mouse (es meloxicam, 3 mg / kg sc). Rimuovere il mouse dal telaio, posizionarlo sotto una lampada di calore, e osservare fino a che non riprende conoscenza. Non restituire un topo che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
NOTA: Expmanipolazioni erimental quali l'associazione di genere e ambiente di arricchimento possono essere avviate o ripresi il giorno dopo l'intervento chirurgico al più presto. - Monitorare loro peso corporeo, comportamento generale e l'aspetto quotidiana. Trattare segni di infezione (ad esempio gonfiore, arrossamento, pus) intorno incisioni chirurgiche con attualità pomata antisettica. Trattare tutti i segni di malattia, il dolore, lo stress o disagio (ad esempio la perdita di> 10% del peso corporeo, ritiro sociale, la mancanza di governare, "smerigliatura", movimento disfunzioni, convulsioni) con analgesici e / o antibiotici sistemici necessari.
- Euthanize topi se> 15% di perdita di peso o sintomi di malattia, il dolore, lo stress o disagio non sono recuperabili entro 1 settimana di trattamento curativo.
- Applicare pomata antisettica ai margini della pelle, e somministrare un antinfiammatorio al mouse (es meloxicam, 3 mg / kg sc). Rimuovere il mouse dal telaio, posizionarlo sotto una lampada di calore, e osservare fino a che non riprende conoscenza. Non restituire un topo che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
3. tessuto cerebrale Preparazione, immunoistochimica Processing, e Stereology
- Perfusion
- Subito dopo manipolazioni / droga ambientali, preparare il cervello per lo studio.
- Prima somministrare una overdose di anestetico per uccidere i topi (ad esempio 100 mg / kg ip sodio pentobarbitone). Una volta anestetizzato ma prima che il cuore smette di battere, porre il mouse sulla sua schiena e cravatta o definire con precisione entrambi arti anteriori.
- Usando un bisturi tagliare via la pelle sovrastante torace poi incise attraverso il muscolo appena sotto la gabbia toracica nella cavità addominale. Inserire un morsetto sul processo xifoideo della gabbia toracica e sollevare la gabbia toracica e lontano dal fegato esporre il diaframma.
- Tagliare il diaframma e attraverso le nervature laterali su entrambi i lati con forbici grandi fino alla cassa toracica può essere ripiegato sopra la testa per esporre i polmoni e il cuore. Usando forbici sottili fanno una piccola incisione nell'atrio destro come un punto di uscita di sangue e soluzioni perfusi, poi tagliare attraverso la base del ventri sinistraCLE e posizionare una cannula attraverso il ventricolo sinistro, l'atrio sinistro, e nell'aorta.
- Fissare la cannula in posizione poi pompa calda (37 ° C) eparinizzate e 0,1 M tampone fosfato fisiologica (PBS) attraverso il sistema vascolare fino soluzione uscendo nell'atrio destro è completamente priva di sangue. Successivamente, la pompa fredda (4 ° C) soluzione fissativa (ad esempio 4% paraformaldeide in PBS) attraverso il sistema vascolare finché l'intero mouse è ben fissato. Rimuovere il cervello e il luogo in PBS con il 30% di saccarosio per 2-3 giorni fino a quando i lavandini del cervello.
NOTA: Altri tipi di preparazione del tessuto possono essere applicati a seconda della perizia in laboratorio corrispondente.
- Subito dopo manipolazioni / droga ambientali, preparare il cervello per lo studio.
- Preparazione di criosezioni gratuita flottante
- Tagliare sezioni seriali attraverso le regioni cerebrali di interesse e raccogliere questi in PBS.
NOTA: Abbiamo tagliato 40 sezioni micron di spessore con un criostato. Altri tipi di sezionamento del tessuto possono essere applicati a seconda della competenza nel corriLaboratorio ng.
- Tagliare sezioni seriali attraverso le regioni cerebrali di interesse e raccogliere questi in PBS.
- Immunoistochimica
- Eseguire immunoistochimica standard per le proteine di interesse. Incubare sezioni 5% siero di capra normale e 0,3% triton X-100 in PBS a temperatura ambiente per 30 min, poi immunoreact con coniglio policlonale anti-TH (1: 400) a 4 ° C per 48 ore, poi policlonale di capra anti biotinilato -rabbit (1: 1.000) a temperatura ambiente per 2 ore.
- Successivamente, incubare in avidina-perossidasi (1: 500) a temperatura ambiente per 1 ora, poi in cobalto e nichel-intensificato diammino-benzidina (0,5 mg / ml) a temperatura ambiente per 18-20 min; per l'ultimo 3-5 min di incubazione diamino-benzidina aggiungere perossido di idrogeno (0,01%) per catalizzare precipitazione cromogeno. Lavare sezioni tre volte per 10 minuti ciascuno in PBS prima, dopo, e tra ciascuno dei passaggi precedenti.
- Montare le sezioni su vetrini da microscopio gelatinizzati, aria asciugarle, poi macchia Nissl (rosso neutro), disidratano in alcool, chiaro (X-3B), e coprioggetto.
- Stimare il numero totale di neuroni TH + e TH SNc (LC e VTA e) con metodi stereologici imparziali. Assicurarsi che il stereologist è cieco per il trattamento ricevuto. Escludi glia sulla base del diametro di soma <5 micron e contare solo le cellule con un nucleo visibile.
- Identificare il SNc (e VTA e LC) per le posizioni spaziali di cellule TH + e anatomici famosi / confini secondo l'atlante del cervello di Paxinos e Watson 7. Contare TH + cellule entro un conteggio telaio (55 x 55 um = 3025 micron 2) ad intervalli predeterminati regolari (x = 140 micron, y = 140 micron per SNc; x = 100 micron, y = 100 micron per VTA e LC) nel corso di ogni nucleo in ogni quarta sezione.
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Representative Results
Topi adulti sottoposti a queste manipolazioni ambientali hanno alterato il numero di mesencefalo (snc e VTA), ma non LC, TH + neuroni, e EE più concomitante infusione mesencefalo di una picrotossina o bicucullina (GABA A antagonisti dei recettori) abolisce EE-induzione di più SNc TH + neuroni. Questi dati sono stati precedentemente pubblicati in 6. I dati presenti sono stati raccolti in esperimenti replicati eseguiti come parte di tale studio precedente, ma non sono stati pubblicati altrove.
In particolare, adulti topi maschi che sono stati accoppiati con topi femmina adulti hanno più TH + SNc e VTA (mesencefalo) neuroni rispetto ai maschi in coppia con i maschi, mentre le femmine in coppia con i maschi hanno meno TH + snc e VTA neuroni rispetto alle femmine accoppiate con le femmine (Figura 1 a 6). Un altro esempio è fornito qui in figura 1, che mostra immediatamente la media ± SE numero di neuroni TH + Snc a topi maschi e femmine following genere accoppiamento. I maschi in coppia con le femmine per 7 giorni hanno circa il 12% in più di TH + snc neuroni rispetto ai maschi in coppia con i maschi (due colonne blu in figura 1). Al contrario, le femmine accoppiate con maschi hanno circa il 12% in meno di TH + snc neuroni rispetto alle femmine accoppiate con le femmine (due colonne rosse in figura 1).
Il numero di TH + SnC e VTA neuroni aumenta anche in adulti topi maschi soggette a EE (figura 2 in 6), e EE-induzione di più SNc TH + neuroni è abolito dal blocco concomitante dei recettori GABA A mesencefalo (Figura 3 in 6). Un altro esempio è fornito qui in figura 2, dove con EE infusione veicolo comportato circa 14% più TH + SNC neuroni che SH con infusione veicolo (sinistra due colonne in Figura 2). Tuttavia, EE con GABA A infusione antagonista del recettore (o 10 micron picrotossina o 51; M bicucullina) completamente abolita questo aumento (due colonne a destra nella Figura 2). Nota, questi dati sono da controlaterale SNc alla cannula di infusione, e sono quasi identici agli effetti osservati nel SNc ipsilaterale che sono stati segnalati in 6.
Figura 1:. Effetti di accoppiamento genere sul numero di SNc TH + neuroni Subito dopo 7 giorni di accoppiamento genere (protocollo 1.1) topi adulti sono stati perfusi (3.1), il mesencefalo è stato sezionato (3.2), le sezioni sono state trattate per la tirosina idrossilasi (TH , l'enzima limitante nella sintesi DA) immunoistochimica (3.3), e il numero di neuroni TH + SNC sono stati stimati utilizzando stereologia (3.4). Tracciata qui sono la media ± SE numero di SnC TH + neuroni in topi maschi in coppia con topi maschi (n = 4 topi maschi da n = 2 coppie maschio-maschio, luce col bluumn), i maschi in coppia con donne (n = 6 topi maschi di coppie 6 maschio-femmina, colonna blu scuro), femmine in coppia con donne (n = 8 topi femmina da n = 4 coppie femmina-femmina, luce colonna rossa), e femmine accoppiate con maschi (n = 6 topi femmina da n = 6 coppie maschio-femmina, colonna rosso scuro). Abbinamento con il sesso opposto ha comportato un aumento del numero di SNc TH + neuroni nei maschi, ma una diminuzione del numero di Snc TH + neuroni nelle femmine (p <0,001 One-way ANOVA; * p <0.05 Tukey confronti a coppie multipli).
Figura 2: Effetti dell'ambiente arricchimento con GABA mesencefalo un blocco del recettore del numero di SnC TH + neuroni Immediatamente dopo 14 giorni di arricchimento dell'ambiente (protocollo 1.2) con l'infusione concomitante di entrambi veicolo, il GABA Un antagonista del recettore p.icrotoxin (10 mM), o GABA Un antagonista del recettore bicucullina (5 mM) nel mesencefalo sinistra (protocollo 2), topi maschi adulti sono stati perfusi (3.1), il mesencefalo stato sezionato (3.2), le sezioni sono state preparate per la tirosina idrossilasi ( TH, l'enzima limitante nella sintesi di DA) immunoistochimica (3.3), e il numero di TH + neuroni nel giusto (controlaterale) SNc sono stati stimati utilizzando stereologia (3.4). Tracciata qui sono la media ± numero SE di SnC TH + neuroni in serie ospitato (SH) topi maschi con infusione di veicolo (n = 6, luce colonna blu), ambiente arricchito (EE) maschi con infusione di veicolo (n = 6, primo blu scuro colonna), EE maschi con picrotossina infusione (n = 6, seconda colonna blu scuro), e maschi EE con bicucullina infusione (n = 6, terza colonna blu scuro). EE ha comportato un aumento del numero di SNc TH + neuroni, ma questo è stato abolito per infusione di picrotossina o bicucullina nel mesencefalo controlaterale (p <0,001 One-way ANOVA; * P <0.001 Tukey confronti a coppie multipli).
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Discussion
Manipolazioni ambientali
La motivazione alla base della progettazione di queste manipolazioni ambientali (abbinamento di genere e di arricchimento ambientale) è stato quello di determinare se l'ambiente, e / o il comportamento richiesto dall'ambiente, è associata a cambiamenti nel numero di mesencefalo neuroni DA. L'attenzione è quindi di fornire ambienti e stimolando comportamenti che potrebbero coinvolgere la segnalazione DA mesencefalo. Questi abbinamento incluso con il sesso opposto, e arricchimento ambientale che comprende l'accesso alla corsa ruote, corde, scale, tunnel, e gli oggetti da esplorare, giocare, arrampicarsi, nascondersi, e nido. Entrambi questi ambienti dovrebbero promuovere ricompensa motivati cognitive, comportamenti emotivi e motori, che sono stati associati con aumenti acuti mesencefalo scarica neuronale DA e rilascio di DA (ad esempio 8). La nostra ipotesi è stata che sono anche associati con i cambiamenti più duraturi nel mesencefalo br segnalazione DAdovrebbe da cambiamenti nel numero di mesencefalo neuroni DA. Qui e altrove 6, la prova viene presentata che questo è davvero il caso.
Le nostre indagini hanno iniziato a utilizzare il protocollo di associazione di genere (1,1) perché comprende un comportamento primordiale ed essenziale nucleo ricompensa-motivazione (es copulazione). Inoltre, riproduttivo, legame di coppia, e comportamenti sociali sono noti per indurre cambiamenti analoghi in altri sistemi neurochimici (ad esempio cambiamenti nella densità di ossitocina, vasopressina e cellule ormone di rilascio della corticotropina in ipotalamo 9). Infatti, dopo 7 giorni di accoppiamento continuo con il sesso opposto, vi mostriamo qui e altrove 6 che i maschi hanno circa il 10% in più di TH + neuroni del mesencefalo mentre le femmine hanno circa il 10% in meno TH + neuroni del mesencefalo [Nota: Questi effetti comprendono SNc (studio e 6) e VTA 6, ma non il locus coeruleus 6, dove TH aiuta sintetizzare noradrenalina].Questo supporta l'idea che il numero di mesencefalo neuroni DA nel cervello adulto non è fisso, ma varia a seconda delle interazioni ambiente, comportamento, o un ambiente / comportamento. Altre prove sostiene questi cambiamenti sono causati da cambiamenti nell'espressione del gene TH e proteine in neuroni del mesencefalo esistenti, al contrario di DA neurogenesi o degenerazione. (1) DA neurogenesi nel mesencefalo topo adulto verifica sia affatto 10-14, oa prezzi molto inferiori che può spiegare l'aggiunta di circa 500 nuovi neuroni SNc DA in una settimana 15,16. (2) Gli studi che quantificano cambiamenti nel numero di neuroni SnC seguenti due settimane infusioni di vari farmaci mirati l'attività elettrica dei neuroni del mesencefalo hanno infatti evidenziato variazioni pari (ancora circa il 10%), ma opposte TH cellule + e TH, con conseguente nessun cambiamento netto il numero totale di cellule 4,5. Questo è coerente con la regolazione dei livelli di proteine TH sopra o sotto immunoistochimiche detlivelli ectable senza aggiunta o sottrazione di neuroni. (3) Molti studi hanno riportato cambiamenti di attività-dipendente in TH genica e proteica all'interno delle cellule su un lasso di tempo di diverse ore 17-23, e la stessa è stata segnalata in mesencefalo 4.
La questione si pone quindi quali sono i meccanismi alla base di cambiamenti nell'espressione del gene TH e proteine in neuroni del mesencefalo esistenti. Le possibilità includono steroidi sessuali, che possono essere alla base sia le differenze di base a numero di TH + neuroni del mesencefalo in maschi e femmine, come i cambiamenti di genere e (aumenti nei maschi e nelle femmine) diminuisce seguenti accoppiamento riportato qui e in precedenza 6. Un'altra possibilità è la regolazione attività-dipendente di espressione TH. SnC e VTA neuroni (sia DA e non-DA) ricevono input sinaptico prevalentemente dallo striato, ipotalamo, nucleo subtalamico, e frontale corteccia 24. Nel contesto di accoppiamento genere, questi ingressipotrebbero essere oggetto di un comportamento sensomotorio, olfatto, feromoni, lo stress, il metabolismo, o la riproduzione. Regolazione attività-dipendente di espressione TH potrebbe essere mediata attraverso calcio o di segnalazione neuropeptide percorsi che interessano l'espressione di geni e proteine (ad esempio 1).
Per aiutare a distinguere tra steroidi sessuali contro i meccanismi di attività-dipendente alla base degli effetti di accoppiamento genere sul numero di mesencefalo neuroni DA abbiamo impiegato il protocollo arricchimento ambientale (1.2), controlli che meglio contro la potenziale influenza degli steroidi sessuali e forse anche altri ormoni ( ad esempio feromoni, stress, riproduzione), e per la potenziale influenza dell'attività neuronale afferente-driven. Il fattore rilevante ecco i diversi gruppi erano molto più simili in termini di genere (tutti maschi), gli ormoni, lo status sociale e lo stress. Anche se lo stato sociale e lo stress possono ancora variare tra i gruppi (ad esempio, un maschio più dominante e aggressivain un gruppo), è improbabile che questo sarebbe sempre lo stesso gruppo (es EE), e gli effetti di EE sono stati ora replicato più volte 6. In EE, l'ampiezza dell'aumento TH + mesencefalo neuroni era la stessa come nel protocollo di accoppiamento genere (confrontare maschi in figure 1 e 2 presente studio, e Figure 1 e 2 in 6). Inoltre, l'aumento di EE-indotta in Snc TH + neuroni indotte da un arricchimento ambientale è stata completamente abolita dal blocco concomitante dei recettori GABA A mesencefalo (Figura 2 studio e la figura 3 in 6), che forniscono circa il 70% di tutti gli input afferenti al mesencefalo DA neuroni in 25. Insieme, questi dati indicano attività neurale afferente-driven è almeno altrettanto potente influenza sul numero di mesencefalo neuroni DA gli ormoni.
Approfondire la conoscenza del fatto ambientalers che regolano il numero di mesencefalo TH + neuroni viene dal confronto gli effetti di RW e EE. RW comprende una attività motoria ben imparato, o banali (in esecuzione su ruote), mentre EE comprende una quantità simile di tale attività, sia pure di una maggiore varietà (quali vari giocattoli, ma immutato nel corso dei 14 giorni), più l'esposizione in corso per nuovi giocattoli in il componente SE (1.2.4). I nostri dati precedentemente pubblicati 6 rivelati inesistenti o piccoli aumenti snc e VTA TH + neuroni in RW rispetto ai topi SH, ma aumenta molto più grandi di EE (+ SE) topi. Ciò evidenzia stimolazione sensoriale, la cognizione, la novità e / o apprendimento e la memoria, come più potenti regolatori del numero di neuroni dopaminergici del mesencefalo che l'attività fisica banali solo.
EE è stato ampiamente utilizzato per indurre effetti terapeutici e migliorare la riparazione del cervello in diversi modelli animali di disturbi cerebrali, come l'Alzheimer, la corea di Huntington e Parkinson malattia 26. La natura di tali manipolazioni ambientali è che essi variano ampiamente tra i laboratori (come fanno le condizioni 'normali alloggiato "), tuttavia ci sono aspetti chiave di protocolli EE che sono degni di nota e già trattati 27. EE fornisce una maggiore novità ambientale e della complessità rispetto al corpo di base, in modo da aumentare i livelli di stimolazione sensoriale, attività cognitiva e l'esercizio fisico. Nel progettare esperimenti EE, bisogna prendere in considerazione fattori etologici, comprese le capacità sensoriali e cognitive degli animali e le loro pulsioni istintuali. Come topi (e ratti) sono animali notturni, con le abilità visive inferiori per gli esseri umani, ma eccellente somatosensoriale e acutezza olfattivi, gli oggetti di arricchimento dovrebbero riflettere gli istinti innati e le capacità degli animali da esperimento. Pertanto, è la novità, forma, consistenza e odore di oggetti che possono essere particolarmente rilevante ai topi. Le valutazioni della forza relativa dei moti roditoriosserva- per una varietà di oggetti di arricchimento hanno portato a raccomandazioni per l'inserimento di oggetti masticabili per consentire la possibilità di esercitare fondamentali, specie-tipici comportamenti 28,29. La fornitura di materiale di nidificazione è considerato un componente fondamentale del protocollo di arricchimento e topi istintivamente strappare oggetti di carta o cartone, fornendo così opportunità per attività sensoriali, cognitivi e motori 30,31. È importante, inoltre, che in un esperimento con più gabbie EE, la novità e la complessità equivalente di oggetti è fornita, per minimizzare la varianza all'interno del gruppo EE, e controllo di parametri ambientali simile deve essere esercitata per il gruppo SH. Idealmente, il numero di topi per gabbia dovrebbero essere uguali tra EE e gruppi SH (a meno che gli effetti della dimensione del gruppo sociale sono stati specificatamente studiati), e nessun 'tratta alimentari dovrebbero essere utilizzati in EE, come le differenze tra i gruppi alimentari potrebbe confound tegli interpretazione degli effetti dell'attività cognitiva e esercizio fisico che migliora EE 12. Altre considerazioni chiave sono la durata di esposizione ad un ambiente arricchito e l'età in cui inizia l'arricchimento. Mentre espressione differenziale di geni è stato dimostrato solo dopo 3 ore in un ambiente arricchito 32, periodi di esposizione più lunghi possono essere necessari per modifiche strutturali e funzionali a verificarsi 33,34. Inoltre, la plasticità arricchimento indotta può essere migliorata durante postnatali periodi critici dello sviluppo 35.
Pompa e infusione cerebrale osmotici impianti cannula per infusione di farmaci
La pompa e cannula impianti osmotici sono molto efficaci per la consegna di farmaci direttamente nel cervello. Con l'esperienza, la chirurgia implantare richiede circa 1 ora per ogni mouse. Solo acrilico dentale è sufficiente fissare la cannula in posizione per lunghi periodi (Nota: Siamo andati fino a 28 giorni in oesperimenti ther); non vi è alcuna necessità di hardware aggiuntivo fissaggio quali viti ossee. È importante garantire c'è molto lasco nel tubo che collega la pompa e la cannula per consentire per la testa e il collo massima flessione senza mettere troppo stress sulle connessioni. Ciò è particolarmente vero per l'infusione a lungo termine, in cui la crescita di tessuto connettivo attorno alla pompa può ancorare in posizione riducendo così la flessibilità dell'impianto. Dove possibile, i topi sono alloggiati dopo l'intervento chirurgico per evitare coinquilini danneggiare l'impianto attraverso graffiare, tirare o mordere. La dose di farmaco è in gran parte determinato dalla quantità aggiunta alla pompa. Tuttavia, a questo proposito attenzione dovrebbe essere versato alla portata della pompa, la stabilità chimica del farmaco a 37 ° C, e la velocità di diffusione del farmaco dalla cannula attraverso il cervello. Attualmente pompe disponibile dal produttore in grado di mantenere l'infusione fino a 6 settimane a una portata di 0,15 ml / h; il digiunoest disponibili portata è di 10 ml / h, ma che dura solo per 1 settimana. Tempi di infusione più lunghi possono essere ottenuti eseguendo ulteriori interventi chirurgici minori sostituire pompe esauriti con pompe complete sul retro del tubo di collegamento (cioè senza disturbare la cannula impiantata). L'estensione spaziale del blu di metilene (1% blu di metilene, MW 320, in 0,9% NaCl) diffusione da una cannula impiantato 0,3 millimetri sopra la metà SNc sinistra lungo il suo aspetto mediolaterale stata misurata per estendere dal bordo laterale del mesencefalo ad appena attraverso la linea mediana mediolaterally, e durante l'intera estensione dorsoventrale del mesencefalo (dopo 2 settimane di infusione). Questo è molto più diffusa di un piccolo nucleo come SNc, e la diffusione del farmaco può essere maggiore (o minore) a seconda della sua MW, stabilità chimica, tampone, ecc In effetti, si può dedurre dai dati attuali (Figura 2) che sia picrotossina e bicucullina raggiunto il controlaterale Snc a concentrazi biologicamente attivoons.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isofluorane | Baxter Healthcare Pty Ltd, Baxter Drive, NSW 2146, Australia | AHN3640 | |
| ALZET Osmotic pump 1002 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0004317 | |
| ALZET Brain infusion kit 1 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0004760 | |
| ALZET cannula holder 1 | DURECT Corporation, PO Box 530 Cupertino, CA 95015-0530 | 0008860 | |
| Vertex Monomer Self-curing (dental acrylic solvent) | Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands | n/a | |
| Vertex Self Curing (dental acrylic powder) | Vertex Dental, Postbus 10, 3700 AA ZEIST, The Netherlands | n/a | |
| METACAM (Meloxicam) | Troy Laboratories, 98 long Street, smithfield NSW 2164 Australia | L10100 | |
| Sodium Pentobarbitone | Lethabarb, Virbac, Milperra, NSW, Australia | 571177 | |
| Normal goat serum | chemicon-temecula, CA | S26-Litre | |
| Triton X-100 | Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 | 1.08603.1000 | |
| Polyclonal rabbit anti-tyrosine hydroxylase | Merck Millipore Headquarters , 290 Concord road, Billerica, MA 01821 | AB152 | |
| Polyclonal biotinylated goat anti-rabbit | Dako Australia Pty. Ltd., Suite 4, Level 4, 56 Berry street, North Sydney, NSW, Australia 2060 | EO432 | |
| Avidin peroxidase | Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU | A3151-1mg | |
| Diamino-benzidine | Sigma-aldrich, Castle Hill, NSW 1765 AU | D-5637 | |
| Stereo Investigator | MicroBrightField Bioscience, 185 Allen Brook Lane, Suite 101, Williston, VT 05495 | n/a |
References
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