Pretargeted PET 영상에 대한 Bioorthogonal 역 전자 수요 딜스 - 알더 고리 모으고

요약

생물직교 역전자 수요 Diels-Alder cycloaddition은 암에 대한 효과적이고 모듈화된 사전 표적 PET 이미징 전략을 수립하기 위해 활용되었습니다. 이 프로토콜에서 이 방법론의 단계는 대장암 표적 항체 huA33 및 ⁶⁴Cu 표지 방사성 리간드를 사용하는 모델 시스템의 맥락에서 설명됩니다.

초록

항체는 뛰어난 친화력과 특이성으로 인해 PET 이미징을 위해 암세포에 방사성 동위원소를 전달하기 위한 매우 유망한 벡터가 되었습니다. 그러나 물리적 반감기가 긴 방사성 핵종으로 항체를 표지해야 하는 필요성은 종종 비표적 조직에 대한 높은 배경 방사선 선량을 초래합니다. 이 문제를 피하기 위해 우리는 역 전자 수요 Diels-Alder cycloaddition 반응을 기반으로 하는 사전 표적 PET 이미징 전략을 사용했습니다. 이 방법론은 항체와 방사능을 분리하여 항체의 긍정적인 특성을 활용하는 동시에 약동학적 단점을 피합니다. 이 시스템은 4단계로 구성됩니다: (1) mAb-trans-cyclooctene (TCO) 접합체 주입; (2) 항체가 종양에 축적되어 혈액에서 제거되는 국소화 기간; (3) 방사성 표지된 테트라진의 주입; 및 (4) 구성 요소의 생체 내 클릭 결찰 후 과도한 방사선 리간드의 제거. 당면한 작업에 제시된 예시에서, ⁶⁴Cu-NOTA 표지 테트라진 방사성 리간드와 트랜스-사이클로옥텐 접합 인간화 항체(huA33)를 사용하여 종양-배경 대비가 높은 SW1222 대장암 종양을 설명했습니다. 또한, 사전 표적화 방법론은 ⁶⁴Cu 또는 ⁸⁹Zr로 직접 표지된 방사성 면역 접합체에 의해 생성된 비표적 조직에 대한 방사선량의 일부만으로 고품질 이미지를 생성합니다. 궁극적으로, 트랜스 사이클로옥텐 부분은 모든 비내재화 항체에 첨가될 수 있고 테트라진은 다양한 방사성 동위원소에 부착될 수 있기 때문에 이 프로토콜의 모듈성은 가장 큰 자산 중 하나입니다.

서론

지난 30 년 동안, 양전자 방출 단층 촬영 (PET)는 암의 진단 및 관리에 필수적인 임상 도구가되었다. 항체는 긴 암 바이오 마커에 ​​대한 그들의 절묘한 친화력과 특이성으로 인해 종양 양전자 방출 방사성 동위 원소의 전달을위한 유망한 벡터를 고려하고있다. 항체의 ^{1, 2} 단, 상대적으로 느린 생체 내 약물 동태는 여러 날에 방사성 동위 원소의 사용을 의무화 물리적 반감기. 부분 바디 CT 스캔 달리 - - 조합은 환자의 비 - 표적 기관, radioimmunoconjugates 정맥 따라서 주입되기 때문에 특히 임상 적 의의이다 중요한 합병증 높은 방사선 량을 수득 할 결과를 흡입 투여로 신체의 모든 부분에서, 심문 조직에 관계없이.

이 문제를 우회하기 위해 상당한 노력을 develo의 전념하고있다동시에 내재 약동학 적 한계를 둘러싸하면서함으로써 항체의 유리한 특성을 활용, 방사성 동위 원소 및 표적 부분을 분리 PET 영상 전략의 pment. 이러한 전략은 - 가장 자주 pretargeting 또는 다단계 타겟팅라고 - 전형적으로 네 단계를 채택한다 : (1) 항원 및 방사성 리간드를 모두 결합 할 수있는 항체의 투여; (2) 표적 조직 및 혈액....

프로토콜

윤리 선언문 : 설명 생체 내 동물 실험의 모든 승인 된 프로토콜과 기념 슬로안 케터링 암 센터의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 윤리적 지침에 따라 따라 수행 하였다.

의 Tz-BN-NOTA 1. 합성

1. 작은 반응 용기에 600 μL의 _NaHCO3 완충액 (0.1 M, pH를 8.1) 7 MG-NH ₂ -Bn NOTA (1.25 X ^10-2 밀리몰)을 용해. 용액의 pH를 확인합니다. 필요한 경우, CO ₃ 0.1 M _나트륨이 적은 분취 량을 사용하여 8.1로 용액의 pH를 조정한다.
2. 1.7 ml의 microcentrifuge 관에 0.5 MG의 Tz-NHS (1.25 × 10 ^-3 밀리몰)에 NH ₂ -Bn-NOTA 솔루션을 추가합니다.
   참고 : (Tz)를-NHS는 건식 칭량 또는 건조 DMF 또는 DMSO (<50 μL)의 원액에서 추가 할 수 있습니다.
3. 생성 된 반응 용액을 RT에서 30 분 동안 반응하도록 허용가벼운 교반.
4. ....

결과

실험의 처음 세 단계 -의 Tz-BN-NOTA, huA33에 TCO의 접합의 합성과의 Tz-BN-NOTA의 방사성 표지는 (도 3 및도 4) 구성 - 매우 안정적. 상기 절차의 경우의 Tz-BN-NOTA 구조체는 고 수율 및 고순도로 합성 하였다. ~ huA33 항체는 4.2 ± 0.6 TCO / 단클론 항체로 수정하고, Tz 일-BN-NOTA은> 85 % 붕괴 보정 수율, 그리고 특정 활동> 99 % 방사 화학적 순도 정제 된 방사성 리간드를 얻을 수 ⁽⁶⁴⁾ 구리와 방사성 동위 원소 표지이었다 6.7 MBq의 / nmol의 (그림 5). huA33-TCO 접합체의 반응성 및 테트라 방사선 리간드 방사성 순간 박막 크로마토 그래피 (ITLC)를 사용하여 시험 할 수있다. huA33 - TCO의 약간의 과잉 (6.7 MBq의 / nmol의 특정 활동을 가정, 0.55 nmol의 100 μCi를)이 방사성 동위 원소 표지 된 테트라을 혼합.......

토론

이 PET pretargeted 촬상 전략의 주요 장점은 직접 표지 된 항체에 의해 생성 된 배경 방사선 량의 단지 일부만 타겟 간 배경 화상의 콘트라스트를 종양의 윤곽을 할 수 있다는 것이다. 예를 들어, 여기에 설명 된 대장 암 이미징 시스템에서, 급성 생체 분포 실험의 데이터는 표지 된 ⁶⁴ CU-NOTA-huA33 ⁸⁹ ZR-DFO-huA33 함께 ⁶⁴ Cu- 기 pretargeting 전략 선량 계산을 수행하는 데 사용 하였다. 임상 적으로 더 관련 ZR ⁽⁸⁹⁾ 표지 된 항체와 비교할 때 이러한 계산 명확 특히 pretargeting 시스템의 선량 이점을 예시한다. 0.4162 mSv를 / MBq의 : ⁸⁹ ZR-DFO-huA33의 30 배 이상 높은 반면 pretargeting 전략의 유효 선량은 0.0124 mSv를 / MBq의입니다. ^(64)에 비교할 때 pretargeting의 선량 이익을 덜.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Tetrazine NHS Ester	Sigma-Aldrich	764701	매장 -80 ° C
트랜스 사이클로 옥텐 NHS 에스테르	시그마 - 알드리치	764523	-80 °에 저장; C
p-NH2-Bn-NOTA	Macrocyclics	B-601	-80 ° 씨