Abstract
Biyolojik olarak aktif kimyasal etki şeklinin belirlenmesi, akademik, ilaç geniş bir ilgi ve endüstriyel bilim göstermektedir. Saccharomyces cerevisiae ya da çiçek mayası bir model ökaryot olduğu ~ 6.000 gen silme mutantları ve hypomorphic elzem genin tam bir koleksiyon mutantlar ticari olarak temin edilebilir. Mutantlar bu koleksiyonları sistematik bir kimyasal tolere gerekli kimyasal gen etkileşimler, örneğin genleri tespit için de kullanılabilir. Bu bilgiler, sırayla, bileşiğin etkime olası moduna bildirir. Burada maya tomurcuklanma kimyasal genetik etkileşimin hızlı tespit edilmesi için bir protokol açıklar. Bu eylem, iyi tanımlanmış bir mekanizmaya sahiptir, kemoterapötik madde, 5-flüorourasil (5-FU), kullanılarak yöntemi göstermektedir. Sonuçlarımız, nükleer TRAMP eksozom ve DNA onarımı enzimler önceki m ile tutarlıdır 5-FU mevcudiyetinde çoğalma için gerekli olan RNA olduğunu göstermektedirtabanlı barkod kimyasal genetik yaklaşımlar ve 5-FU olumsuz hem RNA ve DNA metabolizmasını etkilediğini bilgiyi icroarray. Bu, yüksek verimli taramalara gerekli doğrulama protokolleri de tarif edilmektedir.
Introduction
genetik araçlar ve model organizma Saccharomyces cerevisiae mevcut kaynakların topluca genler ağları biyolojik sistemlerin gerekliliklerini yerine getirmek olarak işlev nasıl yeni anlayış sağlamak büyük ölçekli fonksiyonel genomik çalışmalar sağlamıştır. Bu araçların taşı maya 1,2 bütün açık okuma çerçeveleri zorunlu olmayan gen silme komple bir set işbirlikçi kurulmasıdır. Çarpıcı bir gözlem, standart laboratuvar koşulları altında haploidlerin olarak yetiştirilen maya genlerinin ~% 20 canlılığı için gerekli oldu. Bu alternatif, biyolojik yolların kullanılması ile genomik düzensizliklerin karşı tampon bir hücrenin yeteneğini ortaya koymaktadır. Genetik ayrı ayrı yaşayabilir mutantlar, ancak birlikte öldürücü, bağlı veya yakınsak paralel biyolojik yollar sinyal ve biyolojik işlevi açıklayan genetik etkileşim ağları oluştururlar. Koşullu te gelişmesiyle birlikteEsas teşkil eden genlerin mperature duyarlıdır ve hypomorphic allelleri teknolojisi esansiyel olmayan genlerin 3,4 çalışması ile sınırlı değildir. Bu kavram, benzer hücresel proseslerle genlerin 5 bir araya gelip nasıl çalıştığını gösteren bir tarafsız genetik etkileşimin ilk üreten bir genomik ölçekte uygulanmıştır.
Genetik ağların Kimyasal tedirginlikler mimik gen delesyonlar (Şekil 1) 6. Aşırı duyarlılık için, silme soylarının yüksek yoğunluklu dizisine doğru büyüme önleyici bileşikler sorgulama kimyasal stresi tolere için gerekli olan genlerin bir listesini, yani, kimyasal bir genetik etkileşim profili tanımlar. Genetik etkileşimleri gibi kimyasal kütüphanelerin büyük ölçekli ekranlar aksiyon küme bir araya 7 benzer bir modu ile bileşiklerin göstermiştir. Bu nedenle, bir bileşiğin kimyasal genetik etkileşim profili oluşturarak, etki mekanizmaları lar ile karşılaştırarak tahmin edilebilirge-ölçekli sentetik genetik ve kimyasal genetik etkileşim 8,9 veri setlerini.
Bileşiklerin puanları, sorguya büyük ölçekli kimyasal-genetik ekranlar, barkod rekabet analizleri ile yapılmıştır. Bu yaklaşımda, silme soylarının havuzlanmış toplama kimyasal içeren, küçük bir ortam hacmi içinde birkaç nesil için topluca yetiştirilir. Her bir kromozom anormalliği mutantı, tek bir genetik barkod barındırır için, silme soylarının havuz içinde tek tek mutantlann canlılığı / büyüme mikrodizi veya yüksek sekanslama 10 tarafından izlenir.
Bir biyolojik olarak aktif bileşiği içeren bir katı agar üzerinde büyütülmüş, fiziksel olarak dizilmiş mutantların kolonilerini izleyerek uygunluk çıkarım da kimyasal bir genetik etkileşimleri 11,12 tanımlamasında çok etkili bir yöntemdir. Bu yaklaşım, rekabete dayalı tarama için maliyet-etkin bir alternatif sunuyor ve kimyasallar küçük kütüphaneler tahlil için uygundur.Burada özetlenen S. kimyasal genetik etkileşimin bir listesini üretmek için bir basit bir yöntemdir biyoloji manipülasyonlar veya altyapı moleküler dayanmaz cerevisiae. Bu sadece bir maya silme koleksiyonu, bir robot veya manuel çivileme aparatı ve serbestçe kullanılabilir görüntü analizi yazılımı gerektirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Bu prosedür genel iş akışı, Şekil 2'de belirtilmiştir.
Büyüme inhibe edici Doz 1. belirlenmesi
- Maya, gece boyunca kültürün hazırlanması
NOT: Bu protokolde kullanılan maya-özü-pepton-dekstroz büyüme ortamı (YEPD) standart tarifi 13 olduğunu.- BY4741 (mata his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) bir YEPD agar plakası üzerine hücreler üzerinden çizik ve 30 ° C de ya da görünür koloniler oluşana kadar 48 saat boyunca inkübe edilir.
- Tek bir koloni ile steril bir kültür kabı içinde YEPD sıvı ortam 5 ml aşılayarak bir gecelik kültürler olarak hazırlanır. Sürekli dönme veya çalkalama ile 30 ° C'de gece boyunca inkübe edin. Kültür tipik sabah (~ 2 × 10 8 hücre / ml) doygunluk ulaşacak.
- Katı ağar ortamının hazırlanması çeşitli kimyasal maddeyi ihtiva eden
- Birkaç stokları hazırlayınkimyasal, uygun bir çözücü içinde, 100x arzu edilen nihai konsantrasyonda test edilecek.
Not: etkili konsantrasyonları kimyasal bağlıdır ve tecrübi olarak tespit edilmelidir. Yüksek mM düşük mcM gelen, yani; Başlangıçta geniş bir nihai konsantrasyon aralığını test etmek bu nedenle tavsiye edilir. - Kimyasal her bir konsantrasyonu için, bir kaç steril kültür tüpüne kısım erimiş YEPD agar 3 ml test edilecek. 55 ° C su banyosunda Yeri katılaşan tutmak için.
- Test edilecek olan kimyasal her bir konsantrasyonu için, bir 12-çukurlu plaka içindeki çift havuzdan her bir çifti içine erimiş ortam, girdap karıştırmak için 2-3 saniye ve pipet 1 mi 100x bileşik 30 ul ekle. Yalnızca kontrol bir araç dahil emin olun. Plakalar oda sıcaklığında bir gece boyunca bekleyin. Herhangi bir ekstra medya atın.
- Birkaç stokları hazırlayınkimyasal, uygun bir çözücü içinde, 100x arzu edilen nihai konsantrasyonda test edilecek.
- Forma kaplama hücreler
- Aşama 1 'de olduğu gibi, gece boyunca büyütüldü doymuş bir maya kültürünün 2 ul ile YEPD sıvı ortam 10 ml inoküle.1.2.
- Yuva başına seyreltilmiş maya kültürü 25 ul steril cam boncuklar veya çubuk ile düzgün biçimde yayılmış ve plaka, bir alev altında kurumasına izin plaka. 48 saat süre ile 30 ° C 'de plaka inkübe edin.
- Plakalar üzerinde maya büyüme (koloniler hem toplam sayısını ve boyutunu) değerlendirir. Ekran gerçekleştirmek için daha fazla% 10 -15% gelişimini çoğunlukla inhibe etmemektedir bileşiğin bir alt öldürücü konsantrasyonunu belirleyin.
2. Sistematik Kimyasal genetik Ekran
- Kaynak Plate silinmesi mutant-dizi Bakım (DMA) ve Hazırlık
- Gliserol stoklarından silme mutant diziler inşa ilgili ayrıntılı bilgi için Baryshnikova ark. 14 bakınız. Iptal mutantlarının plaka başına 384 koloni bir yoğunluğa dizilmiş edildikten sonra, DMA, 4 ° C'de birkaç ay boyunca saklanabilir. Her birine büyüyen koloniler önlemek için G418 gerekli 200 ug / ml ihtiva eden YEPD agarı üzerinde çoğaltmaDiğer.
NOT: Birden seri tekrarlamalı yavaş büyüyen suşlar kaybını önlemek ve baskılayıcı mutantlar görünümünü en aza indirmek için kaçınılmalıdır. Bu haploidlerin gibi koleksiyonları muhafaza eğer özellikle ilgilidir. - Robotik sistem arraying bir mikrobik kullanarak tüm çoğaltma kaplama adımları uygulayın. Alternatif olarak, manuel çivileme araçlarını kullanarak koloniler dizilmiş manipüle.
NOT: maya silme toplama çeşitli ticari kaynaklardan haploidlerin ve diploid olarak kullanılabilir ve tipik olarak 96 oyuklu plakalar içinde gliserol stoklan halinde sevk edilir.
- Gliserol stoklarından silme mutant diziler inşa ilgili ayrıntılı bilgi için Baryshnikova ark. 14 bakınız. Iptal mutantlarının plaka başına 384 koloni bir yoğunluğa dizilmiş edildikten sonra, DMA, 4 ° C'de birkaç ay boyunca saklanabilir. Her birine büyüyen koloniler önlemek için G418 gerekli 200 ug / ml ihtiva eden YEPD agarı üzerinde çoğaltmaDiğer.
- Silme mutant dizi Yoğuşmalı
- G418, 200 ug / ml ihtiva eden YEPD agar ortamı 250 ml hazırlayın. G418 etkili konsantrasyon değişebilir ve her bir çok deneysel olarak test edilmelidir.
- Plaka başına G418 200 ug / ml ihtiva eden YEPD agar 50 ml dökülerek beş YEPD agar hazırlayın. Dizi yoğuşmalı önce bu bir gün yapın ve plakalar oda sıcaklığında soğumaya bırakınerature gecede düz bir hatta yüzey üzerinde.
NOT: Dört tabak 1.536-gerilme yoğunluğu toplanması için gerekli olacak, beşinci plaka ekstra olarak dökülür. - Plaka başına 384 koloni bir yoğunlukta mutant silme koleksiyonu içeren 16 Petri kapları çıkarın ve oda sıcaklığında (~ 1 saat) gelmek için izin verir.
- Hassas bir görev silme kullanarak her plakanın kapak üzerinde oluşturulmuş olan herhangi bir yoğunlaşma silin. Su damlacıkları neden olabilir Aksi takdirde dizi ve dizilmiş mutantlar çapraz kontaminasyon biriken ediliyor.
- Mikrobiyal dizi iğneleme robotu kullanarak, plaka başına 1.536 koloniler (4 Petri kapları) plaka başına 384 koloniler (16 Petri kapları) bir yoğunluktan DMA yoğunlaşmak. Plaka 1 pimleri 1. koloni yoğunlaştırılmış dizinin 1 sütun 1 satır böylece bu gerçekleştirin, plakanın 2 1. koloni 1 sütun 2, 2 ve sütun 1 satır plakanın 3 1. kolonisi satır, ve plakanın 4 1. koloni 2 satır içinSütun 2.
- Gecede 30 ° C'de konsolide dizi inkübe.
- Kaynak plakalardan kolonilerin üniforma aktarımını sağlamak için dizi inceleyin. DMA doğru (Şekil 4A) yoğunlaşmış olan sağlamak için bir rehber olarak hizmet bilerek diziye dahil birçok boş pozisyonları, olacak.
Not: Bu test bileşiği ihtiva eden ortam üzerinde çoğaltma kaplama için kaynak plakaları olacaktır. Tek bir kaynak plakası birden pinnings için kullanılabilir. Ayrıca birçok robotlar her zaman transfer ediliyor maya benzer numaraları sağlayacak bir mahsup özelliği, sahip olacaktır.
- Kopya plaka silme mutant dizisi
- Kontrol, 700 ml (yalnızca araç) ve deney ortam (kimyasal ihtiva eden) 700 ml hazırlayın. Bu üç nüsha olarak tahlil (koşul başına 12 plakaları, artı iki ekstra) gerçekleştirmek için yeterli.
- Test kimyasal veya plaka başına denetimi içeren YEPD agar 50 ml dökün. Plakalar t izin vero düz bile yüzeyde gece boyunca oda sıcaklığında soğutun.
- Çoğaltma plakasına robot kullanarak, deneysel belirlenen konsantrasyonda kimyasal içeren plakalar üç set yanı sıra araç denetimi içeren plakalar üç set üzerine DMA aşılamak. 24-48 saat süre ile, oda sıcaklığında inkübe edin.
3. Görüntüleme Tabaklar ve Veri Analizi
- Inkübatör plakaları çıkarın ve oda sıcaklığında (~ 1 saat) önce görüntüleme gelmek için izin verir. Bu plakaları görüntüleme sırasında yoğunlaşmayı engeller.
- Kapağı çıkarmadan ve bir düz yatak tarayıcı yüzü aşağı koyarak 24 ve 48 saat sonra görüntü plakaları. En az 300 dpi çözünürlükte görüntüler yakalayın. Alternatif olarak, görüntü yakalamak için bir dijital kamera kullanın. Bunu yaparken ise, yer plakaları karanlık bir arka plan üzerinde yukarı yüz ve görüntü kapakları kaldırın.
NOT: Plakaların dosya formatı ve konumlandırma kullanılan miktar programına bağlıdır. Ölçümlerini ve balony 15, SGAtools 16, ve ScreenMill 17 dahil olmak üzere birçok açık kaynak programları, birini kullanarak dizi koloni boyutları karşılaştırma yapın.
Ekran 4. Doğrulama
NOT: Bu aşamada çeşitli maya silmeleri mutantlar ilgi kimyasal olarak aşırı duyarlı atar. Bu kimyasal-genetik etkileşimler önümüzdeki iki şekilde valide edilmelidir. İlk duyarlı suşların kimliği PCR ile teyit edilmelidir. İkincisi, kimyasal duyarlılık bağımsız attı gerekir. Aşağıda belirtilen gerilme aşırı duyarlılık, maya biyoloji yaygın bir teknik doğrulamak için tespit tahliller yapmak için kısa bir protokoldür.
- Streak dışarı G418 200 ug / ml içeren YEPD agara maya silme koleksiyonundan (hipersensitif) mutantlar istenen. Koloniler oluşana kadar 30 ° C'de inkübe edilir. Primerler göre diagnostik PCR ile soyun genotip doğrulamaÜreticinin protokolü.
- Her bir suş için YEPD sıvının 5 ml inoküle ve dönme ya da çalkalama ile 30 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
- OD 600 ölçün ve steril dH 2 O. 600 = 1 OD her gerginlik sulandırmak Bunlar şimdi normalize maya kültürleri vardır.
- 96 oyuklu bir plaka de A1 normalize yabani tip maya (BY4741), kültür, 100 ul koyun. Kuyular B1-H1 kadar yedi ek suşların 100 ul koyun.
- A6-H6 ile kuyular A2-H2 steril dH 2 O 90 ul dağıtmak için bir çok kanallı pipet kullanın. Son olarak, normalleştirilmiş maya kültürlerinin 1:10 seyreltme serisi hazırlanır. Seri bir çok kanallı pipet ile sütun 2 sütun 1, 10 ul pipetleme başlayın ve altı seyreltme yapılana kadar 96 oyuklu plaka boyunca devam (yani, 10 0-10 -5).
- Bir çok kanallı kullanarak bir tablo içinde seyreltilmiş maya kültürleri 2-5 ul aktarınKimyasal ve araç kontrolünü içeren YEPD katı ortama pipet. 24-48 saat için uygun sıcaklıkta inkübe edin.
- Plakaları kontrol edin ve (BY4741 kontrole göre) kimyasal select mutantların duyarlılığını karşılaştırmak. Görüntü 24 de plakaları ve adım 3.2 olarak 48 saat.
Not: ilgili gen ontolojilerinde veya fonksiyonlar ile bir kaç hiperduyarlı suşunun ekran geçerliliği güvenilir olmaktadır birlikte, genin vahşi tip bir kopyasını içeren bir plazmid ile aşırı duyarlı bir silme soyunun transformasyonu resmi bir gen kurmak için gerekli olan Çevrede silinmesi (ve gizli ikinci sitesi mutasyonlar) ilaç hassasiyeti neden olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yaklaşımın bir doğrulama olarak, yukarıda tarif edilen protokol izlenerek, kemoterapötik madde, 5-florourasil (5-FU) temsil eden bir kimyasal genetik etkileşimin ekran gerçekleştirilir. 5-FU, timidilat sintaz gibi DNA ve RNA metabolizmasını 18 bozmak için bilinmektedir. 5-FU kimyasal genetik etkileşimler de çalışılmış ve heterozigot ve homozigot silme koleksiyonları 8,19 ikisini de kullanarak maya barkod mikroarray teknikleri ile incelenmiştir. Burada içindeki mutant koloni boyutu karşılaştırmalı miktar ölçümleri ile elde edilebileceğini göstermektedir.
Bu yapılan ekran esansiyel olmayan haploid gen silinmesi toplama kullanır unutulmamalıdır. Ekranın Bu tür, aynı zamanda önemli bir gen mutantlan dahil izin diploid suşlar, sıcaklığa duyarlı mutantlar ve hypomorphic alelleri ile gerçekleştirilebilir. Haploid silme koleksiyonu kullanan bir avantajı ilaç Hassas artarhedef yolların Sığ, gen ürününün yokluğu varsa. Bununla birlikte, iki önemli dezavantaj elzem genin aşırı duyarlılık sorgulanan olamaz, ve haployid toplama çok yollu yayım üzerinden seçilir kendiliğinden baskılayıcı mutasyonlar eğilimlidir. Bu koleksiyonun bozulmasına yol açabilir. Böylece, ilaç etkisi dizinin ve duyarlılık bütünlüğü ve genişliği arasında kapalı bir içsel ticaret vardır. Bu dikkate alınmalı ve seçilen en uygun mutant koleksiyon istenen uygulamaya dayalı.
İlk olarak, 5-FU, ilgili alt öldürücü konsantrasyon ekranında kullanılmak üzere (5-FU konsantrasyonu artan BY4741 (MATa his3 Δ1 leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) hücreler yetiştirme ve görsel olarak maya koloni büyüme değerlendirerek 10 uM olduğu saptanmıştır Şekil 3A). Seçenek olarak ise, benzer sonuçlar, artan ye göre elde edilebilirönceki grupların 10,20 tarafından belirtildiği gibi sıvı kültür ve bir mikro-plaka okuyucu (Şekil 3B) kullanılarak kültür optik yoğunluk sık olarak izlenmesi mikrotiter plakalarında ast.
Singer, bir rotor kullanılarak, maya DMA 10 uM 5-FU ya da dimetil sülfoksit (DMSO), kontrol (Şekil 4A) ihtiva eden ortam üzerinde levha yoğunluğu ile 1536 koloni olacak şekilde tekrar edilmiştir. Bu plakalar, oda sıcaklığında 24 saat süre ile inkübe edildi ve bir düz yatak tarayıcı ile görüntülendi. Deney ve kontrol plakaları her mutant için koloni büyüklüğü ölçüm balony görüntü analizi motoru 15 kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Balony yazılımı kontrol etmek deneysel dizi göreli kolonilerin boyut oranını hesaplar. Kullanıcı bir oran eşiğini ayarlamak mümkün ve ekran yapılır eğer en azından bir p-değeri her mutant için tahsis edilecektir üçlü. Dikkate alındı ≤0.8 oranını gösterdi bizim temsilcisi ekran mutantlared vurur olmak. koloni ölçümü sonuçları y ekseni üzerinde her koloni ve x-ekseni üzerinde dizi konumunda (Şekil 4B) veya oranı (Şekil 4C) tarafından sipariş edilen gen silinmesi için boyut oranını çizerek grafiksel sunulabilir.
Sentetik hasta / ekranında tanımlanan ölümcül mutantlar gen ontolojisi (GO) analizi yapılarak işlevsel açıklamaları dayalı toplanabilir. S. listelerinin GO analizi için çeşitli kamuya açık araçlar vardır S. cerevisiae genleri; Funspec 21, DAVID Biyoinformatik Veritabanı 22,23, ve Saccharomyces Genom Veritabanı (SGD) Git Dönem Finder 24 olmak üzere. 5-FU, ekran 0.8 daha az ya da buna eşit bir oranı gen silme Funspec için bir giriş listesi olarak kullanılmıştır. Funspec sistematik veya yaygın maya gen adlarının bir listesini kabul eder ve ot yanı sıra gen ontolojilerinde, fonksiyonel sınıflandırmalar, lokalizasyonu, protein kompleksleri özetleri çıkışlarıBu listede zenginleştirilmiş onun kullanışlı sınıflandırmalar. gerçekleştirilen temsili ekran uridin modifikasyonu ve RNA gözetim makine ve DNA hasarı (Tablo 1) tepki, tRNA wobbles dahil, RNA metabolizması için ontolojilerin bir zenginleştirme gösterdi. Bu sonuçlar, nükleer Trf / Rrp6 / Hava / Mtr4 Poliadenilasyon (TRAMP) exosome 25 tarafından işlenir poliadenileştirilmiştir kodlamayan RNA'ların, birikimi 5-FU tedavi sonuçlarını göstermiştir önceki çalışmalarla katılıyorum. Bu nedenle bu bulgular, daha önce kimyasal bir genetik ekranlar ile anlaşma ve 5-FU biyoaktivite 8,19 bilinen bir mekanizma bulunmaktadır.
Tüm yüksek verimli fonksiyonel genomik yaklaşımlarla gibi sonuçları doğrulamak için gereklidir. Kimyasal genetik etkileşimler maya mutantlar ilk hedef genin promotör ve KanMX bozulma kaset içinde tavlama primerler ile PCR-valide edilmelidir doğrulamak için. Geçerlidir soyların seçimitirme güçlü bir fenotip göstermek ve grup işlevsel iyi bir başlangıç noktası sağlar biraz keyfi, ancak öncelik mutantlar olduğunu. Sonraki, bir kimyasal aşırı duyarlılık lekelenme deneyleri, maya mutantlar uygunluğunu ölçmek için ortak bir yaklaşım kullanılarak teyit edilir. Bu amaçla, maya kökü seri seyreltme uygun kimyasal dozun yanı sıra, bir denetim ihtiva eden ortam üzerinde ızgara fark vardır. Bir örnek olarak, (Şekil 5), TRAMP kompleksinin air1 ve trf5 mutantları ile, 5-FU kimyasal bir genetik etkileşimin teyit etmektedir. Bu genler, TRAMP nükleer eksozom bileşenlerini kodlamaktadır. Biz çekirdek Tramp 3'-5 'ekzonükleaz aktivite eksik rrp6 suşu, bizim laboratuvar yüksek yoğunluklu DMA koleksiyonunda kayıp olduğunu unutmayın. Taze rrp6 mutantını elde biz bu rrp6 teyit ve 5-FU Ayrıca TRAMP aktivitesi 5-FU tolere için gerekli olan tesis, kimyasal bir genetik etkileşimi gösterir. Bu göstermektedirBüyük silme koleksiyonları bütünlüğü uygun DMA bakım ve gerilme doğrulama kritik hale zamanla tehlikeye olabilir ki.
Bizim Ekran aynı zamanda hassas 5-FU gibi (Rad50, rad52 ve Mre11 dahil) birçok DNA onarım enzimleri mutantlar belirledi. Koloni büyüklüğü Puanlama yabani tipiyle karşılaştırıldığında, 0.7, 0.65 ve 0.42 olarak 10 uM 5-FU ile bu mutantların göreli uygunluk gösterdi. Bizim doğrulayıcı lekelenme deneyleri (Şekil 5) dayanarak, bu değerler nedeniyle koloni boyutu skorlama ile spor ölçüm sınırlı dinamik aralığı bir rakamın muhtemeldir. Bu bağımsız seri lekelenme ile etkileşimleri onaylamak için ikinci bir nedeni vurgulamaktadır: Bazı kimyasal, genetik etkileşimlerin büyüklüğü birincil veri analizinde göz ardı edilebilir. Bizim sonuçları üçer kez, ~ 4.800-suşu haploid silme koleksiyonu ile gerçekleştirilen bir büyüme tabanlı kimyasal genetik ekran, yeterli resol sağladığını göstermektedir Katkı güvenle özel kimyasal genetik etkileşimleri izole etmek.
Şekil 1:., Kimyasal pertürbasyonuna aşırı duyarlılığa yol açan kimyasal genetik Etkileşimlerinin şematik bir temsilidir gen silme kimyasal hedef biyolojik süreçlerin tanımlanmasına olanak tanımaktadır. (A) Yakınsak yolları ya gen silme (edilmesi Bir) veya kimyasal (geneB) tarafından bozulabilir. Tek tek, bu hücresel hakaretler nedeniyle biyolojik yolların doğasında fazlalık için tolere edilebilir. Bununla birlikte, kombinasyon hücre yaşamı sürdürme kabiliyetinde bir ya da sentetik olarak hasta veya ölümcül bir fenotip ile sonuçlanmıştır taviz verilmektedir. (B) aşırı duyarlılık neden olabilir ve kimyasal muamele ile kesintiye uğramış biyolojik yollar gösterir kimyasal stresle indüklenen azaltmak için kritik genin (Genec) silinmesi. jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 2: Kimyasal genetik Ekran için iş akışı alt önleyici doz (A) belirlenmesi. Ebeveyn maya suşları durağan faz kadar büyütülür, suyla 1: 5000, ve yayılma artan kimyasal dozunu ihtiva eden bir katı madde, YEPD ortam üzerinde plakalanmıştır. den daha fazla olmayan% 10-15 büyüme inhibisyonu sahip olan en yüksek konsantrasyon, DMA karşı taranması için seçilir. (B) Sistematik Kimyasal Genetik Ekran: S. robot iğneleme yüksek verimli dizi kullanma cerevisiae DMA sınaması kimyasal uygun konsantrasyonunu içeren medya üzerine kaplama kopyasıdır. Plakalar, 24-48 saat boyunca oda sıcaklığında kuluçkaya yatırılır görüntülü ve nispi koloni büyüklüğü belirlenir.ref = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52345/52345fig2highres.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 3 :. Alt-inhibe edici konsantrasyonun belirlenmesi. 5-fluouracil içeren katı ortam üzerinde BY4741 hücrelerin (A) Büyüme. Doymuş BY4741 kültürü içinde 1: 5000 ve 5-florourasil artan konsantrasyonları ile kaplama. 5-Fluorourasil'in ihtiva eden sıvı ortamda BY4741 hücrelerinin (B), büyüme eğrisi. ~ 4 x 10 4 hücreleri 22 saat boyunca her 10 dakikada bir ölçüldü 5-FU ve ODS'nin artan konsantrasyonlarda üç kopya halinde çökelmiştir.
Şekil 4: 5- Kimyasal genetik EkranFluorourasil. (A) S. cerevisiae silme mutant dizisi 10 uM 5-FU (sağ) içeren YEPD agar ve DMSO kontrolü (solda) çoğaltılır. (B) kimyasal genetik tarama sonuçları: dizi pozisyonu ile sıralı DMSO kontrolü ile karşılaştırıldığında 10 uM 5-FU ile mutantların göreceli büyüme. Koloni büyüklüğü oranı ile sıralı DMSO kontrolü ile karşılaştırıldığında 10 uM 5-FU ile mutantların (C), bağıl büyüme. ≤0.8 bir oran eşiği iki grafikte de gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: Kimyasal Genetik Etkileşimlerin Doğrulama. DMSO Kontrol (A) yetiştirilen bazı izole edilmiş mutant soylarının seri seyreltileri, 10 uM 5-FU (
| GO Kategori | P-değeri | Tespit Genler (hit) | # Hit | GO Kategori Genlerin toplam # |
| tRNA bocalama uridin değişiklik [GO: 0002098] | 2.24 × 10 -6 | SIT4 NCS6 URM1 KTI12 IKI3 TUM1 ELP3 | 7 | 24 |
| transkripsiyon, DNA-bağımlı [GO: 0006351] | 1.69 × 10 -5 | PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 RPA14 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 MET18 CTK2 RPB4 SWI3 RPA12 KTI12 ash1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 | 32 | 540 |
| çeviri [GO: 0006412] | 4.28 × 10 -5 | RPL19B RPS11B FES1 RPS9B RPL31A RPL24A RPL7A RPS25A RPL26B RPL11B RPL27A RPL34B RPL14A TEF4 RPS29A RPL6A AEP1 RPS16A MRP7 RPS19B RPS19A RPS7A | 22 | 318 |
| tRNA yalpalama pozisyon uridin thiolation [GO: 0002143] | 1.88 × 10 -4 | NCS6 URM1 TUM1 | 3 | 5 |
| transkripsiyon düzenlenmesi, DNA-bağımlı [GO: 0006355] | 4.98 × 10 -4 | PDR3 LDB7 HIR1 HAP3 ROX3 SPT7 SNF5 SAC3 HMO1 NGG1 SPT3 IES6 AFT1 RAI1 STB5 SDS3 SWI3 KTI12 ash1 SWI6 IKI3 GCR2 POP2 LEO1 SSN3 SGF11 ELP3 | 27 | 507 |
| Protein urmylation [GO: 0032447] | 6.33 × 10 -4 | NCS6 URM1 URE2 | 3 | 7 |
| yanıt çekirdekten mRNA ihracat [sıcak stresineGO: 0031990] | 2.04 × 10 -3 | RPB4 NUP120 NUP133 | 3 | 10 |
| Nükleer poliadenilasyon bağımlı CUT katabolik süreci [GO: 0071039] | 2.04 × 10 -3 | AIR1 TRF5 MPP6 | 3 | 10 |
| triptofan metabolik süreç [GO: 0006568] | 2.15 × 10 -3 | TRP5 TRP3 | 2 | 3 |
| Erken Golgi taşıma endozom [GO: 0034498] | 2.75 × 10 -3 | ENT5 TCA17 RCY1 | 3 | 11 |
| ribozomal küçük alt birimi biogenesis [GO: 0042274] | 3.63 × 10 -3 | SAC3 LTV1 RPS19B RPS19A | 4 | 24 |
| kromatin modifikasyon [GO: 0016568] | 3.64 × 10 -3 | LDB7 HIR1 SPT7 NGG1 SPT3 SDS3 ash1 SGF11ELP3 | 9 | 114 |
| ATP metabolik süreç [GO: 0046034] | 4.23 × 10 -3 | VMA2 VMA1 | 2 | 4 |
| vaküoler proton taşıyan V-tipi kompleks aksamını ATPaz'ın [GO: 0070072] | 4.23 × 10 -3 | VMA21 VPH2 | 2 | 4 |
| kromozom yerelleştirme [GO: 0050000] | 4.23 × 10 -3 | NUP120 NUP133 | 2 | 4 |
| mRNA taşımacılığı [GO: 0051028] | 4.59 × 10 -3 | DHH1 SAC3 LOC1 KAP114 NUP120 NUP133 | 6 | 58 |
| vakuoler asitlenme [GO: 0007035] | 4.89 × 10 -3 | VMA2 VMA1 VMA5 VPH2 | 4 | 26 |
| nukleus gelen rRNA ihracat [GO: 0006407] | 5.63 × 10 <sup> -3 | NUP120 NUP133 RPS19B RPS19A | 4 | 27 |
| endositoz [GO: 0006897] | 6.57 × 10 -3 | SLA1 EDE1 CDC50 ART5 RCY1 VPS1 END3 | 7 | 82 |
| mRNA 3'-uç işleme nükleer mRNA gözetim [GO: 0.071.031] | 6.92 × 10 -3 | AIR1 MPP6 | 2 | 5 |
| ncRNA poliadenilasyon [GO: 0043629] | 6.92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| Nükleer poliadenilasyon bağımlı snoRNA katabolik süreci [GO: 0071036] | 6.92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| Nükleer poliadenilasyon bağımlı snRNA katabolik süreci [GO: 0071037] | 6.92 × 10 -3 | AIR1 TRF5 | 2 | 5 |
| triptofan biyosentetik süreci [GO: 0000162] | 6.92 × 10 -3 | TRP5 TRP3 | 2 | 5 |
| ER zarında içine protein ekleme [GO: 0045048] | 6.92 × 10 -3 | GET1 GET4 | 2 | 5 |
| mRNA stabilizasyon [GO: 0048255] | 6.92 × 10 -3 | ATP25 IGO1 | 2 | 5 |
| DNA hasarı uyarana cevap [GO: 0006974] | 7.05 × 10 -3 | MUS81 RAD2 MET18 CTK2 RPB4 GRR1 DEF1 MMS22 RAD52 Mre11 Rad50 RMI1 | 12 | 197 |
| GO Kategori | P-değeri | Tespit Genler (hit) | "> # hitGO Kategori Genlerin toplam # | |
| Nükleer poliadenilasyon bağımlı rRNA katabolik süreci [GO: 0071035] | 8.46 × 10 -3 | AIR1 TRF5 MPP6 | 3 | 16 |
Tablo 1: Gen ontoloji (GO) 5-Fluorouracil Hassas Mutantlarının Karakterizasyonu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kimyasal genetik etkileşim profilleri oluşturmak için bir yaklaşım burada özetlenen. yöntem basittir: bir kimyasal maddenin varlığı ve yokluğunda geniş gen silinmesi koleksiyonlarında, her bir suş koloni boyutları karşılaştırarak, bir kimyasal hakaret tolere gerekli genler tespit edilir. Hassas soyların ortaya çıkan listesinin Açıklaması zenginleştirme analizi, daha sonra bir etki kimyasal moduna ilişkin bilgi temin etmek üzere kullanılabilir. Bu protokol, maya tomurcuklanma için optimize edilmiş olsa da, aynı zamanda, örneğin E.Coli olduğunda, diğer dizilen mikrobiyal silme koleksiyonları ile kullanım için uyarlanabilir Hücresel tedirginlikler 26,27 yüzlerce incelemek için başarıyla kullanılmaktadır coli Keio koleksiyonu.
Maya ve diğer organizmalarda Kimya-genetik profilleme iyi bilinmektedir. Bu çalışmaların çoğunluğu mikroarray analizi veya yüksek verimli aşağıya bakınız yoluyla silme mutantlar toplanmış miktarını rekabet deneyleri yararlanmıştırBenzersiz genetik barkod encing. Bu yaklaşım, geniş kimyasal kütüphanelerin sağlam kimyasal genetik profilleri üretiminde başarılı olduğu kanıtlanmıştır. Burada tarif edilen yöntemler, test bileşiklerinin, daha az sayıda kimyasal genetik analizi için kullanışlı bir alternatif sağlar. Tahlil yüksek verimlilik sıralaması veya mikroarray analizi daha az maliyetlidir ve dizi önyargı muzdarip değil basit bir okunmasını sağlar. Özetlenen protokol koloni manipülasyon için bir robot araç gerektirir olsa, bu tür sistemlerin dönüşümlü protokol malzemeleri listesine dahil edilmiş örnekleri manuel çivileme araçları ile kullanım için ayarlanmış olabilir, daha uygun hale gelmesi ve.
Bu genel olarak bu yaklaşımı ve kimyasal genetik profilleme sınırlarının farkında olmak önemlidir. İlk olarak bileşik, tomurcuklanan mayada canlılığı üzerinde bir etkiye sahip olmalıdır, ya da belirli bir organizma kullanılmaktadır. Birçok temel biyolojik süreçler ikenve işlevleri de hücrelere kimyasal alımı olacak gibi ökaryot organizma spesifik kimyasal bir genetik etkileşimler, geniş çapta değişebilir arasında muhafaza edilir. Ayrıca, çeşitli delesyon streynleri çoklu ilaç tedavileri 8 duyarlı olduğu tespit edilmiştir unutulmamalıdır. Bu ilaç efflux, kof fonksiyonu, ve membran bütünlüğü içerisinde yer alan genleri vardır. Bu doğrudan ve dolaylı eylem modları ile sonuçlar yaparken göz çoklu ilaç direnci dikkate almak önemlidir.
Burada tarif edilen ekran haploid silme toplama, mayada kimyasal Genetik analiz için ortak bir yoldan yapılabilir. Eylem kimyasal bileşiğin modunun belirlenmesi de yardımı kullanılabilir maya mutantların birden çok koleksiyon şimdi vardır. Bu tam homozigot ve heterozigot diploid silme koleksiyonları, ama aynı zamanda koşullu ısıya duyarlı temel gen mutantlar, Decré sadece içerirMevcut araçlar inanılmaz derinliği, kolay Verilen epigenetik dayalı moleküler tedaviler 3,4,28 araştırmak için kullanılan olabilir mRNA pertürbasyon (çiğ) maya mutant kütüphane ve bir sentetik histon H3 ve H4 mutant toplama, tarafından ASED Bolluk metodoloji ve gerekli sınırlı altyapı, bu yaklaşım, bir kimyasal bileşiğin mekanizmasına göre zengin fonksiyonel bilgilere erişmek için erişilebilir bir format sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
CJN laboratuarında Araştırma NSERC, Kanada Kanser Derneği Araştırma Enstitüsü (CCSRI) ve Kanada Meme Kanseri Vakfı (BC-Yukon Şubesi) faaliyet hibe tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast Extract | BioBasic | G0961 | For YEPD liquid/solid media add to 1% final concentration (w/v) |
| Tyrptone Powder | BD Biosciences | 211820 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| Dextrose | Anachemia | 31096-380 | For YEPD liquid/solid media add to 2% final concentration (w/v) — do not autoclave. Prepare 20% stock solution, filter sterilize, and add to media after autoclaving. |
| Agar A | Bio Basic | FB0010 | For YEPD solid media add to 2% final concentration (w/v) |
| G418 | A.G. Scientific Inc. | G-1033 | Prepare 1,000x stock at 200 mg/ml in dH2O and filter sterilize. |
| 12-well plate | Greiner Bio One | 655180 | |
| 5 ml culture tubes | Evergreen Scientific | 222-2376-080 | |
| 10 cm Petri Dish | VWR | 25384-302 | |
| ROTOR HDA | Singer Instruments | ROT-001 | high-throughput microbial array pinning robot |
| PLUSPLATE© Petri Dish | Singer Instruments | PLU-001 | Box of 200 dishes |
| 384 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-384 | Box of 1,000 pads |
| 1536 Short-Pin RePad | Singer Instruments | RP-MP-1536 | Box of 1,000 pads |
| Alternative Pinning Tools: | |||
| Fully Automated Robtic Systems | S&P robotics | http://www.sprobotics.com | Several automated colony handling robitic and imagining systems available. |
| Manual Pinning Tools | V&P Scientific | http://www.vp-scientific.com | Handheld replication tools and accessories. |
References
- Giaever, G., et al. Functional profiling of the Saccharomyces cerevisiae genome. Nature. 418, 387-391 (2002).
- Winzeler, E. A., et al. Functional characterization of the S. cerevisiae genome by gene deletion and parallel analysis. Science. 285, 901-906 (1999).
- Breslow, D. K., et al. A comprehensive strategy enabling high-resolution functional analysis of the yeast genome. Nat Methods. 5, 711-718 (2008).
- Li, Z., et al. Systematic exploration of essential yeast gene function with temperature-sensitive mutants. Nat Biotechnol. 29, 361-367 (2011).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327, 425-431 (2010).
- Parsons, A. B., et al. Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways. Nat Biotechnol. 22, 62-69 (2004).
- Parsons, A. B., et al. Exploring the mode-of-action of bioactive compounds by chemical-genetic profiling in yeast. Cell. 126, 611-625 (2006).
- Hillenmeyer, M. E., et al. The chemical genomic portrait of yeast: uncovering a phenotype for all genes. Science. 320, 362-365 (2008).
- Hillenmeyer, M. E., et al. Systematic analysis of genome-wide fitness data in yeast reveals novel gene function and drug action. Genome Biol. 11, R30 (2010).
- Smith, A. M., et al. Competitive genomic screens of barcoded yeast libraries. J Vis Exp. (54), (2011).
- Bowie, D., Parvizi, P., Duncan, D., Nelson, C. J., Fyles, T. M. Chemical-genetic identification of the biochemical targets of polyalkyl guanidinium biocides. Organic & Biomolecular Chemistry. 11, 4359-4366 (2013).
- Alamgir, M., Erukova, V., Jessulat, M., Azizi, A., Golshani, A. Chemical-genetic profile analysis of five inhibitory compounds in yeast. BMC Chem Biol. 10 (6), (2010).
- Amberg, D. C., Burke, D., Strathern, J. N. Cold Spring Harbor Laboratory. Methods In Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2005).
- Baryshnikova, A., et al. Synthetic genetic array (SGA) analysis in Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 470, 145-179 (2010).
- Young, B. P., Loewen, C. J. Balony: a software package for analysis of data generated by synthetic genetic array experiments. BMC Bioinformatics. 14, 354 (2013).
- Wagih, O., et al. SGAtools: one-stop analysis and visualization of array-based genetic interaction screens. Nucleic Acids Res. 41, W591-W596 (2013).
- Dittmar, J. C., Reid, R. J., Rothstein, R. ScreenMill: a freely available software suite for growth measurement, analysis and visualization of high-throughput screen data. BMC Bioinformatics. 11, 353 (2010).
- Longley, D. B., Harkin, D. P., Johnston, P. G. 5-fluorouracil: mechanisms of action and clinical strategies. Nat Rev Cancer. 3, 330-338 (2003).
- Lum, P. Y., et al. Discovering modes of action for therapeutic compounds using a genome-wide screen of yeast heterozygotes. Cell. 116, 121-137 (2004).
- Toussaint, M., Conconi, A. High-throughput and sensitive assay to measure yeast cell growth: a bench protocol for testing genotoxic agents. Nat Protoc. 1, 1922-1928 (2006).
- Robinson, M. D., Grigull, J., Mohammad, N., Hughes, T. R. FunSpec: a web-based cluster interpreter for yeast. BMC Bioinformatics. 3, 35 (2002).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4, 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37, 1-13 (2009).
- Hong, E. L., et al. Gene Ontology annotations at SGD: new data sources and annotation methods. Nucleic Acids Res. 36, D577-D581 (2008).
- Fang, F., Hoskins, J., Butler, J. S. 5-fluorouracil enhances exosome-dependent accumulation of polyadenylated rRNAs. Mol Cell Biol. 24, 10766-10776 (2004).
- Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 0008 (2006).
- Nichols, R. J., et al. Phenotypic landscape of a bacterial cell. Cell. 144, 143-156 (2011).
- Dai, J., et al. Probing nucleosome function: a highly versatile library of synthetic histone H3 and H4 mutants. Cell. 134, 1066-1078 (2008).
