Protocol
מחקר זה בוצע באישורה של המדינה סקסוניה וסקסוניה-אנהלט, Regierungspraesidium דרזדן / האלי, על פי סעיף 8 לחוק הגרמני להגנה על בעלי חיים (24D-9,168.11-1 / 2008-24).
בידוד תא 1
1.1 הכנת עצם הירך לבין השוקה
- להרדים את העכבר באמצעות 5% ריכוז isoflurane על ידי אידוי isoflurane לפח סגור. לאחר העכבר הפסיק לזוז במשך 3 שניות, לבצע הנקע בצוואר הרחם.
- לחטא את הגפיים האחורי עם אתנול (96%). להסיר את העור ושרירים ולהפריד את העצמות עם אזמל סטרילי.
- התחל עם חתך בעור מפשעה, ולהרחיב את החתך לכיוון malleolus המדיאלי ולבצע נתיחה חוזר של העור סביב העגל הנמוך. הסר את העור של הרגליים לחלוטין על ידי לקלף אותה proximally.
- לנתק את השריר הארבע ראשי מעצם הירך עם אזמל חד, תסיר את שני peroneus הקדמיוקבוצות השרירים הגסטרוקנמיוס וdisarticulate הרגל במפרק הירך על ידי איתור ולנתח את הרצועות.
- התחל anteriorly ולהמשיך סביב המפרק על ידי הסיבוב בזהירות את הרגל וtransecting הרצועות, ובכך disarticulating המשותף.
- לשטוף עצם ירך ועצם שוק עם 96% אתנול למשך תקופה מינימאלית של 90 שניות כדי להבטיח הכנת תא ספטית. להמשיך את תהליך השטיפה עם PBS סטרילי כדי לשטוף נותר אתנול.
הערה: כל הצעדים הבאים חייבים להיות סטרילי כדי למנוע זיהום.
1.2 קצירה של מח העצם
- חותך את הקצה הפרוקסימלי והדיסטלי של כל עצם עם זוג מספריים קנס כדי לקבל גישה לפירי הירך ושוקה. תיזהר עם צעד זה, שכן העצמות האלה לשבור בקלות רבה.
- לשטוף את העצמות עם מדיום חם (M199 10% בסרום + עגל עוברי (FCS), + 1% פניצילין / סטרפטומיצין). השתמש במחט סטרילית 28-G, מזרק 1 מיליליטר, ובין 10-15 מיליליטר בינונייםעצם לשטיפה.
- החזק את העצם עם מלקחיים עדינים ולשטוף אחד אחד עד שהוא הופך שקוף למחצה. זהירות להחיל לחץ בסופו של בוכנת המזרק על מנת למזער מתח תא.
- סנן את מח העצם באמצעות אינטרנט ניילון 70 מיקרומטר ולאסוף התסנין. כדי לחלץ את הכמות המרבית של מח עצם, לשטוף שוב ושוב מהקצוות דיסטלי ופרוקסימלי.
- יש לשטוף את המסננת עם PBS ולאסוף התסנין. לסלק פסולת בזהירות וקונגלומרטים סלולריים על ידי ערבוב וpipetting עדינים.
1.3 טיפוח
- צנטריפוגה ההשעיה התא ב 250 XG במשך 10 דקות ב RT. בטל supernatant ו resuspend התאים עם כ 25 מיליליטר של מדיום. חזור פעם אחת.
- Resuspend תאי 6 מיליליטר של מדיום לאחר שלב הכביסה השני. מערבבים 50 μl של פתרון התא עם 50 μl של trypan כחול. ספירת התאים בתא ספירה תחת מיקרוסקופ אור. לחשב את מספר גאמות בפתרון באמצעות נוסחה זו:
- זרעי התאים על צלחות משטח נמוך במיוחד מצורף 6-גם למניעת הדבקה קבועה לתחתית הצלחת. השתמש בריכוז של 10 6 תאים למ"ל עם עד 6 מיליליטר לכל טוב.
- להשלים את ההשעיה עם M-CSF מיליליטר / 20 ng לקדם התמיינות תאים.
- תרבות התאים במשך 5 ימים ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ולבחון מדי יום.
1.4 קצירה של תאים
הערה: עליך לבצע פעולות אלה על קרח. המשך עם או 1.4.1 או 1.4.2 בהתאם.
- בשלב זה, לקצור את התרבות כולה, כולל מקרופאגים המובחנים שידבקו לתרבות-הצלחות, גם אם הם צלחות משטח נמוך במיוחד קובץ מצורף.
- לקצור את כל התרבות על ידי pipetting העדין וניתוק עם פתרון של 4 מעלות צלזיוס PBS, 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA) ו- 2 mM EDTA. חזור על פעולה עד הצלחות ברורות של שנותר תאים חסיד - לאשר תחת מיקרוסקופ אם אינך בטוח.
- לחלופין, לבטל מקרופאגים חסיד על ידי איסוף supernatant עם התאים בתרחיף, שבעיקר מכילים מונוציטים.
- קציר התאים שאינם חסיד עם פתרון של PBS ללא EDTA וBSA 0.5%. אין ליישם בכוח רב מדי על מנת להימנע מפירוק מקרופאגים המעטה חסיד.
1.5 FACS-ניתוח (אופציונאלי)
הערה: ניתן לרוקן את ההשעיה התא של תאי stem- ואב CD117 + על ידי השימוש בMACS. להשתמש בפרוטוקולי יצרן להליך זה.
- קציר התאים על פי שני שלבים 1.4.1 או 1.4.2.
- צנטריפוגה התאים ב 250 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C ולחזור על פעולה זו שוב.
- Resuspend לפחות 250,000 תאים ב300 μl של FACS בuffer לבדיקה.
- העבר את פתרון תא על 96-היטב צלחת (30 μl לכל היטב).
- צנטריפוגה ההשעיה התא ב 250 XG במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- הסר את supernatant ולהוסיף 25 μl של נוגדן לכל טוב (דילול יצרן שימוש).
- כתם התאים עם נוגדנים (להלן פרוטוקולי יצרן לתא phenotyping לאחר צעדי 1.5.1-1.5.6. סמנים בשימוש נפוץ לזיהוי מונוציטים / מקרופאג כוללים CD11b, F4 / 80 (איור 3), CD115 (איור 2), וGr- 1.
הערה: לתיאור נוסף של פתרונות סלולריים, השימוש בסמנים כמו CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G, וCD192 מומלץ. מאפיינים סלולריים תוארו בעבר 12. - דגירה הבדיקות במשך 20 דקות על 4 מעלות צלזיוס.
- צנטריפוגה הבדיקות ב 250 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס וגלולה עם 200 μl של חיץ FACS. ה חזורהוא צעד פעמיים.
- העבר את הבדיקות לתוך צינורות FACS ולבצע ניתוח FACS 12.
- ביצוע ניתוח FACS 12 ביום 0, 3 ו -5 לנתח התמיינות תאים.
הזרקה לוריד 2. זנב
2.1 הכנה
- לחמם את בעלי החיים על צלחת חימום על 37 מעלות צלזיוס למשך כ -10 דקות. שים לב לבעלי החיים בזמן ההתחממות לזהות סימנים של התחממות יתר.
- Resuspend מונוציטים, מבודדים בצעדי 1.1- 1.4, ב -150 μl של NaCl, ולטעון את התאים לתוך מזרק אינסולין 1 מיליליטר עם מחט 30G. קל מערבולת הפתרון לפני טעינת המזרק על מנת להבטיח את כל מונוציטים מוזרקים. תמיד להתמודד עם תאים על קרח, כדי למנוע עיקול בתיווך חום והפעלה של מונוציטים.
2.2 הרחקה
- הימנע מלהפריע עכברים אחרים בכלוב בעת בחירת עכבר להזרקה תוך ורידית.
- מניחים את העכבר לעוצר. הימנע יותר מדי יחסי ציבורחסימת חצוצרות ולהיות זהירות עם הגפיים האחורי. (איור 4)
הערה: לחלופין, להשתמש בהרדמה כללית כדי להבטיח טיפול ללא מתח של בעלי החיים. - ודא שיש לו את העכבר מרחב לנשימה לפני סגירת העוצר.
2.3 הזרקה
- לחטא את אזור ההזרקה עם סוכן חיטוי. תרסיס על הזנב של העכבר ולתת לעמוד במשך דקות לפחות 1.
- לעצור את זרימת דם ורידית של הזנב על ידי הפעלת לחץ עדין לצד זנב לרוחב מעל אתר ההזרקה, ראות טובה יותר של הוורידים.
- הפעל את הזנב 90 מעלות, לפני ההזרקה. (איור 5)
- להזריק בזווית של 45 מעלות. להזריק לאט ולא יותר מ 5 μl לז, כדי למנוע פגיעה בבעלי חיים.
- אם יש שלפוחית, וזה סימן של הזרקה נכשלה, להפסיק מייד ולחזור על ההזרקה יותר proximally.
- לעצור את הדימום בצד ההזרקה על ידי יישום p העדיןressure כ 1 דק '.
- בסופו של ההליך, לפתוח את מפשק ומניח את העכבר בכלוב שלה.
- שים לב לעכבר במשך 20 דקות על מנת להבטיח כי בעל החיים לא נפגעו על ידי ההזרקה ומתוחזק כיבה sternal. הארך את הזמן של התבוננות עד העכבר להכרה מספקת. החזר את העכבר לחברה של בעלי חיים אחרים רק לאחר שהתאושש באופן מלא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פתרון התא מופק ממוח העצם העכברי מורכב מסוגי תאים שונים. הסוגים העיקריים של התאים לימפוציטים הם, גרנולוציטים ומונוציטים. ניתן להעריך סוגי תאים על ידי גודל וגרעיניות, המוצג באיור 1 עבור שתי השעיות היליד והתאים שנקטפו לאחר 5 ימים של בידול. שים לב להרכב הסלולרי ההסטה במהלך טיפוח. עם זאת, סיווג מדויק של אוכלוסיות חייב לסמוך על ביטוי ייחודי של סמנים תאיים.
הסמן החשוב ביותר המשמש לזיהוי תאים של המערכת-MPS הוא CD115, המתפקד כקולט M-CSF ובא לידי ביטוי דווקא באבות מונוציטים, מונוציטים ומקרופאגים. לכן, זה לא יכול לשמש לזיהוי MPS-תת ייחודי, אבל באופן מהימן יכול להעריך את הסכום המוחלט של תאים מונעים לבידול מונוציטים / מקרופאג. ראה איור 2 לציר זמן של ביטוי CD115 במהלך שונהentiation.
F4 סמן בגרות / 80 הוא שימושי כדי לבדל מונוציטים לנוער, מונוציטים בוגרים, ומקרופאגים. המקרופאגים להראות ביטוי חזק של F4 / 80 בהשוואה לנוער אבות מונוציטים, אשר הם שליליים עבור הסמן. מונוציטים בוגרים להראות ביטוי ביניים של F4 / 80. שילוב של CD115 וF4 / 80 סמנים לכן מייצג שיטה אפשרית לכימות ומעקב אחר התמיינות תאים (ראה איור 3).
השילוב של CD115 וF4 / 80 הוא מספיק לתצפית שגרתית תרבות ובקרת איכות לפני היישום של תאים. בדיקה מפורטת יותר של מונוציטים נגזרים מח עצם ביום 5 של טיפוח מאשרת תכונות המבניות ותפקודיות שלהם בהתאמה לאלה של מונוציטים בדם היקפיים 12.
חשוב לתקן את העכבר בזהירות בעוצר, הימנעות מתח על הזנב. להגביל freedoמ 'של תנועה ככל האפשר בלי עיכוב נשימה כדי להקל על ההזרקה.
1. לוח שמאלי איור:. הרכב של סוגי תאים ביום 1 בתרבות סוגי תאים לימפוציטים כוללים, מונוציטים וגרנולוציטים. פנל ימני: שים לב להרכב סלולארי ההסטה במהלך טיפוח. אוכלוסיית תא כוללת מונוציטים ומקרופאגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. ציר זמן של ביטוי CD115 במהלך בידול. שימו לב ש> 95% מכלל תאי CD115 חיובי לאחר 5 ימים של בידול, מצביע על כך שהרוב רוב התאים הם או מונוציטים או מקרופאגים. סיווג יכול להיות מבוסס על גודל תא וגרעיניות, אך סמנים תאיים ספציפיים הם אמינות יותר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. הגדלת הביטוי של מונוציטים / סמן בגרות מקרופאג F4 / 80 יום 5:. שים לב למראה של אוכלוסייה עם F4 / 80 ביטוי ביניים, אשר עולה בקנה אחד עם פנוטיפ מונוציטים. יום 7:. שים לב הימנית המשמרת של F4 ביטוי / 80, עולה בקנה אחד עם התבגרות מקרופאג אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
"Src =" e 4 "/> / קבצים / ftp_upload / 52,347 / 52347fig4highres.jpg
איור 4. עכבר קבוע בעוצר להזרקה לוריד זנב. ריסון העכבר לאחר בזהירות, לסובב את הזנב 90 מעלות, עד שהוורידים נראים בצד הגב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
5. חתך סכמטי דמותו של זנב העכבר. התמונה ממחישה את מיקומו של כלי שיט בזנב העכבר. העורקים (אדום) נמצאים בצד הגחון ועל גב, והוורידים הם בצד הלטרלי של הזנב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אנו מתארים שיטה פשוטה וחסכונית לבודד את הכמויות גדולות של מונוציטים עכבריים ממח עצם. בהשוואה לפרוטוקולים אחרים באמצעות דם היקפי, הלהשיג תשואות מונוציטים 5 של 1.4 x10 6, אנו מסוגלים להשיג תשואות גבוהות יותר של 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 מונוציטים מעכבר תורם יחיד.
כאשר שוקלים אתגרים בשיטה זו, חשוב לדבר על הפוטנציאל לזיהום בעת העבודה בתנאים שאינם סטרילי. אם שטיפה והצעדים הכביסה הבאה אינם בעקבות כראוי, זיהום על ידי חיידקים ופטריות הוא סביר. בנוסף, מח עצם מורכב מהשעיות תא הטרוגניות, כוללים גרנולוציטים, לימפוציטים ותאי erythroid. בדרך כלל תאים אלה להיעלם בין היום 2 ו -3 לטיפוח בשל היעדרם של גורמי גדילה. לאחר התמיינות גורם מונע צמיחה, מקרופאגים הם המקור העיקרי לזיהום. כדי לשמור על tהוא המספר של מקרופאגים הנמוכים וכדי למזער את הבידול של מונוציטים למקרופאגים, השימוש בלוחות מצורפים נמוכים במיוחד ושלבי הכביסה שהוזכרו לעיל הם קריטיים.
קשה לזהות סמן שהוא רק של מונוציטים ספציפיים. התערבות בין הסמנים מחייבת שימוש בסמן אחד או יותר, ויש שונות בגרעיניות והגודל של תאים בניתוח השעיות תא. הסמנים והתיאורים מוצגים איורים 1-3 חלופות טובות לסוגי תאי נציג בתרבות. זה יכול להיות קשה להבחין בין הסוגים השונים של התאים, במיוחד אחרי יום 5. לכן זה קריטי להשתמש סמנים אחרים כמו CD115 וF4 / 80.
בהתחשב בהרחבה של תאי מח עצם בתנאים ללא הידבקות, בידול מקרופאג יכול להיות ממושך ומונוציטים מובחנים יכולים לצבור. בידול מקרופאג מציין זיהום; עם זאת, duדואר לטבע הדבק שלהם גם על משטחי טיפוח נמוך במיוחד מצורפים-, הם יכולים להיות מושלכים בקלות בעת קצירת רק תאים שאינם דבקים מהתרבות. בניסויים קודמים 1,3, זיהום על ידי מקרופאגים לא הוביל לתופעות לוואי קליניים רציניות. בירור היסטולוגית של איברים ושרירים של עכברים לאחר השתלת התאים הראה כי מקרופאגים מוזרקים מתבוללים באיברים כמו טחול, בכבד או ריאות. ההטמעה של מקרופאגים באיברים אלה הוכיחה ללא תופעות קליניות נצפות בעכברים. המנגנון המולקולרי מופעל על ידי מקרופאגים אלה יכולים להיות שאלות מעניינות לחקירות נוספות.
מונוציטים כמו גם מקרופאגים להשפיע arteriogenesis במחלת עורקים היקפי, במיוחד כשהם מיושמים באופן מערכתי. תופעות לוואי קליניים כגון תסחיף או דלקת מערכתית מסיבית לא יכולים להיבחן גם לאחר ההזרקה של יותר מ -2.5 מיליון מונוציטים, אבל תאים אלה יכולים לעורר דלקת ופוtentially לגרום לתופעות מערכתיות חמורות. בניסויים בבני אדם, השפעות אלו עשויות להיות להם משמעות קלינית. ליבוי arteriogenesis יכול להשפיע על צמיחת גידול או רטינופתיה סוכרתית, והשפעות מערכתיות אפשריות כזה של פתרונות תא שהוחדרו צריכה להיחקר במחקרים עתידיים.
פרסומים קודמים 9 לתאר הבדלים בין המאפיינים של מונוציטים היקפיים דם ועצם נגזר מח, אשר מסבירים מדוע המאפיינים של מונוציטים ממח עצם יכולים להיות שונים מאלו שבודדו מתאי דם היקפיים.
גם השיטה של בידוד היא עניין קליני. ציור דם במקום לחילוץ מח עצם אנושי הוא יותר מעשי בהקשר של רפואה קלינית. חשוב לדאוג לרווחתם של בעלי החיים וליישם שיכוך כאבים במידת צורך. לזריקות תוך ורידי, זה קריטי לתרגל טיפול הן בעלי החיים ואת המזרק באותו הזמן. אם ani אחתmal עובר זריקות מרובות, איכות הוורידים והעור של הזנב סובלים.
למרות חסרונות אלה, שיטה זו היא מאוד שימושית כדי ללמוד את ההתנהגות ומאפיינים של מונוציטים. ניסויים בתחום טרשת עורקים, אימונולוגיה או דלקת יכולים להפיק תועלת משיטה זו. רק 30 דקות נדרשות מהפקת מח עצם לזריעה של תאים על צלחות משטח נמוך במיוחד מצורף 6-גם. חששות אתיים הם מזעריים, כי התשואה הגבוהה של פרוטוקול זה ממזערת את מספר בעלי החיים הנדרשים כתורמי תא. שיטה חדשה זו תהיה מועילה ללימודים רבים מעורבים מונוציטים.
אנחנו כבר התמקדנו בהגדלה טיפולית של צמיחת כלי טחונות באמצעות השתלה של מונוציטים. טבע multifactorial של תהליך זה עשוי להסביר מדוע גורם יחיד מתקרב לתוצאות מעורבות הגדלת של arteriogenesis יצרו 13,14. זה הוביל בvestigation של טיפולים מבוססי תאים. תאי גזע ואב-מח עצם אוטולוגית נגזר זוהו כפוטנציאל תאים להשתלה, אלא רק יתרונות קליניים מתונים דווחו 15. מלבד מחקר על מינון, שיטות בידוד, ומסלולים ממשל, יש צורך במחקר נוסף עדיין כדי לקבוע את סוג התא האופטימלי. חסרון של השתלת תאי אוטולוגי יכול להיות חוסר היכולת שלהם להפעיל את התגובה החיסונית המולדת ו / או הסתגלות, ושניהם קריטיים לarteriogenesis. הגדלת דלקת מקומית עשויה לייצג את הגירוי הטוב ביותר עבור arteriogenesis 16.
הזרקה תוך ורידית של מונוציטים היא שיטה נפוצה להשתלת תאים בתוך מודלים עכבר אם משלוח סמים מערכתי הוא רצוי. בגלל השפעות מערכתיות, תופעות לוואי יכול להתרחש גם כן. ודא שהווריד מיועד להזרקה. זה נפוץ לבלבל עורקים וורידים, במיוחד כאשר הזרקת מיקרופון פיגמנט בכבדותדואר. הזרקת עורקים יכולה לגרום לתסחיפים, אשר יובילו לבעיות מערכתיות שבמחזור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well-ultra-low-attachment plate | Corning Incorporated, NY, USA | 6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile | |
| 8- 12 week old, male, balb/c mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| 96-well-plate | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Blue dead cell stain | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ||
| Bovine serum albumine | GE Healthcare, Freiburg, Germany | Fraction V, pH 7.0 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 28G, 30G | |
| CD115 | eBioscience, San Diego, USA | 12-1152 | |
| CD11b | eBioscience, San Diego, USA | 53-0112 | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | With cap, steril | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra® X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | Kodan Tinktur forte | |
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Ethanol 96% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Extraction unit Pipetus | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany | ||
| F4/80 | AbD Serotec, Düsseldorf, Germany | MCA497APC | |
| FACS buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3 | |
| FACS device | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | BD FACS Canto II | |
| FACS tubes | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Falcon® pipette | Becton Dickenson Labware, NY, USA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Gr1 | eBioscience, San Diego, USA | 53-5931 | |
| Heating plate | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Incu safe | |
| Isofluran | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 °C | |
| Macrophage-Colony Stimulating Factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Mechanical shaker | IKA, Staufen, Germany | ms2 minishaker | |
| Medium 199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | Warm in 37 °C water bath before use | |
| Micro test tubes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| NaCl | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| NaN3 (sodium acide) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Nylon cellsieve | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | Cell strainer, 70 µm mesh size | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Phosphate buffered saline | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | pH 7.4, sterile | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µl/100µl/200µl/1,000µl | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Serological pipette | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 5 ml, 10 ml | |
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 1 ml Omnifix® -F insuline syringe | |
| Tubes with cap | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | 15 ml/50 ml Cellstar tubes | |
| Warm water bath | Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany | Julabo SW22 |
References
- Herold, J., et al. Transplantation of monocytes: a novel strategy for in vivo augmentation of collateral vessel growth. Hum Gene Ther. 15 (1), 1-12 (2004).
- Herold, J., Tillmanns, H., Xing, Z., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Isolation and transduction of monocytes: promising vehicles for therapeutic arteriogenesis. Langenbecks Arch Surg. 391 (2), 72-82 (2006).
- Francke, A., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C., Herold, J. Transplantation of bone marrow derived monocytes: a novel approach for augmentation of arteriogenesis in a murine model of femoral artery ligation. American Journal Of Translational Research. 5 (2), 155-169 (2013).
- Leon, B., et al. Dendritic cell differentiation potential of mouse monocytes: monocytes represent immediate precursors of CD8- and CD8+ splenic dendritic cells. Blood. 103 (7), 2668-2676 (2004).
- Timmerman, J. M., Levy, R. Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy. Annu Rev Med. 50, 507-529 (1999).
- Salem, M. L. The use of dendritic cells for Peptide-based vaccination in cancer immunotherapy. Methods Mol Biol. 1139, 479-503 (2014).
- Timmerman, J. M., et al. Idiotype-pulsed dendritic cell vaccination for B-cell lymphoma: clinical and immune responses in 35 patients. Blood. 99 (5), 1517-1526 (2002).
- Berthold, F. Isolation of human monocytes by Ficoll density gradient centrifugation. Blut. 43 (6), 367-371 (1981).
- Houthuys, E., Movahedi, K., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Brouckaert, P. A method for the isolation and purification of mouse peripheral blood monocytes. Journal Of Immunological Methods. 359 (1-2), 1-10 (2010).
- Seeger, F. H., Tonn, T., Krzossok, N., Zeiher, A. M., Dimmeler, S. Cell isolation procedures matter: a comparison of different isolation protocols of bone marrow mononuclear cells used for cell therapy in patients with acute myocardial infarction. European Heart Journal. 28 (6), 766-772 (2007).
- Auffray, C., et al. CX3CR1+ CD115+ CD135+ common macrophage/DC precursors and the role of CX3CR1 in their response to inflammation. The Journal Of Experimental Medicine. 206 (3), 595-606 (2009).
- Francke, A., Herold, J., Weinert, S., Strasser, R. H., Braun-Dullaeus, R. C. Generation of mature murine monocytes from heterogeneous bone marrow and description of their properties. J. Histochem. Cytochem. 59 (9), 813-825 (2011).
- Sneider, E. B., Nowicki, P. T., Messina, L. M. Regenerative medicine in the treatment of peripheral arterial disease. Journal Of Cellular Biochemistry. 108 (4), 753-761 (2009).
- Van Royen, N., Piek, J. J., Schaper, W., Fulton, W. F. A critical review of clinical arteriogenesis research. J Am Coll Cardiol. 55 (1), 17-25 (2009).
- Lawall, H., Bramlage, P., Amann, B. Treatment of peripheral arterial disease using stem and progenitor cell therapy. J Vasc Surg. 53 (2), 445-453 (2011).
- Herold, J., et al. Tetanus toxoid-pulsed monocyte vaccination for augmentation of collateral vessel growth. Journal of the American Heart Association. 3 (2), e000611 (2014).
