Protocol
Cette étude a été réalisée avec la permission de l'Etat de Saxe et de Saxe-Anhalt, Regierungspraesidium Dresden / Halle, selon l'article 8 de la loi allemande pour la protection des animaux (24D-9168,11 à 1 / 2008-24).
Une cellule d'isolement
1.1 Préparation du fémur et du tibia
- Anesthésier la souris en utilisant une concentration d'isoflurane à 5% par vaporisation d'isoflurane dans un bac fermé. Après la souris a cessé de bouger pendant 3 secondes, effectuer la dislocation cervicale.
- Désinfecter les membres postérieurs avec de l'éthanol (96%). Enlever la peau et les muscles et séparer les os avec un scalpel stérile.
- Commencez par une incision inguinale de la peau, et d'étendre l'incision vers la malléole interne et effectuer une dissection circulaire de la peau autour du mollet. Retirez la peau des jambes complètement par éplucher proximale.
- Détachez le muscle quadriceps du fémur avec un scalpel, enlever les deux péroné antérieureset les groupes musculaires jumelles et disjoignent la jambe à l'articulation de la hanche en localisant et en disséquant les ligaments.
- Commencez en avant et procéder autour de l'articulation en tournant soigneusement la jambe et sectionnant les ligaments, désarticulant ainsi la commune.
- Laver fémur et le tibia avec 96% d'éthanol pendant au moins 90 secondes pour garantir préparation cellulaire aseptique. Poursuivre le processus de lavage avec du PBS stérile pour rincer éthanol restant.
Remarque: Toutes les étapes suivantes doivent être stériles pour éviter la contamination.
1.2 La récolte de moelle osseuse
- Couper l'extrémité proximale et distale de chaque os avec une paire de ciseaux fins d'accéder aux arbres fémorale et tibiale. Soyez prudent avec cette étape, puisque ces os se cassent très facilement.
- Rincer les os avec un milieu chaud (M199 + 10% de sérum de veau foetal (FCS), + 1% de pénicilline / streptomycine). Utiliser une aiguille stérile 28-G, une seringue de 1 ml, et entre 10 à 15 ml par milieuosseuse pour le rinçage.
- Maintenez l'os avec une pince fine et rincer une par une jusqu'à ce qu'il devienne semi-translucide. Appliquer soigneusement pression à l'extrémité du plongeur de la seringue afin de minimiser le stress cellulaire.
- Filtrer la moelle osseuse à travers un nylon web 70 um et de recueillir le filtrat. Pour extraire la quantité maximale de la moelle osseuse, rincer de manière répétée à partir des extrémités distale et proximale.
- Rincez le tamis avec du PBS et recueillir le filtrat. Déloger soigneusement les débris et les conglomérats cellulaires par agitation douce et pipetage.
1.3 Culture
- Centrifuger la suspension de cellules à 250 xg pendant 10 min à température ambiante. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules avec environ 25 ml de milieu. Répéter une fois.
- Resuspendre les cellules dans 6 ml de milieu après la seconde étape de lavage. Mélanger 50 ul de la solution de cellules avec 50 pi de bleu trypan. Compter les cellules dans une chambre de comptage au microscope optique. Calculer le nombre de caunes dans la solution à l'aide de cette formule:
- Ensemencer les cellules sur des plaques de surface à très faible fixation 6 puits pour empêcher l'adhérence permanente au fond de la plaque. Utiliser une concentration de 10 6 cellules par ml avec jusqu'à 6 ml par puits.
- Compléter la suspension avec 20 ng / ml de M-CSF pour promouvoir la différenciation cellulaire.
- Culture des cellules pendant 5 jours à 37 ° C et 5% de dioxyde de carbone et d'observer tous les jours.
1.4 La récolte des cellules
Remarque: ces étapes doivent être effectuées sur la glace. Procéder à 1.4.1 ou 1.4.2 soit en conséquence.
- À ce stade, récolter toute la culture, y compris les macrophages différenciés qui adhèrent à la culture plaques, même se ils sont des plaques de surface ultra-faible fixation.
- Récolter la culture entière par pipetage doux et détacher avec une solution de 4 ° C PBS, 0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA) et 2 mM d'EDTA. Répétez jusqu'à ce que les plaques sont clairement de rester cellules adhérentes - confirmer sous un microscope en cas de doute.
- Sinon, jetez macrophages adhérentes en récoltant le surnageant avec les cellules en suspension, qui contiennent principalement des monocytes.
- Récolter les cellules non adhérentes avec une solution de PBS sans EDTA et 0,5% de BSA. Ne pas appliquer trop de force pour ne pas déloger les macrophages légèrement adhérentes.
1,5 FACS-analyse (Facultatif)
Remarque: Il est possible d'épuiser la suspension cellulaire de cellules progénitrices et stem- CD117 + en utilisant des MACS. Utilisez protocoles du fabricant pour cette procédure.
- Récolter les cellules selon l'une des étapes 1.4.1 ou 1.4.2.
- Centrifuger les cellules à 250 g pendant 10 min à 4 ° C et répéter cette étape.
- Remettre en suspension au moins 250 000 cellules dans 300 pi de FACS buffer par sonde.
- Transfert solution de cellules sur un 96-bien-plaque (30 pi par puits).
- Centrifuger la suspension de cellules à 250 xg pendant 5 min à 4 ° C.
- Retirer le surnageant et ajouter 25 ul d'anticorps à chaque puits (utilisation constructeur dilution).
- Colorer les cellules avec des anticorps (suivant les protocoles du fabricant pour le phénotypage cellulaire après les étapes 1.5.1-1.5.6. Marqueurs couramment utilisés pour l'identification des monocytes / macrophages comprennent CD11b, F4 / 80 (Figure 3), CD115 (Figure 2), et Gr- 1.
Remarque: Pour une description plus détaillée des solutions cellulaires, l'utilisation de marqueurs comme CD4, CD8a, CD11c, CD25, CD45, CD45R, CD62L, CD80, CD86, CD145, CD117, MHCⅡ, Ly6C, Ly6G et CD192 est recommandé. Caractéristiques cellulaires ont été précédemment décrites 12. - Incuber les sondes pendant 20 min à 4 ° C.
- Centrifuger les sondes à 250 xg pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension avec 200 ul de tampon FACS. Répétez eest l'étape deux fois.
- Transférez les sondes dans des tubes FACS et effectuer l'analyse FACS 12.
- Effectuer l'analyse FACS 12 au jour 0, 3 et 5 pour analyser la différenciation cellulaire.
2. Injection veine caudale
Préparation 2.1
- Réchauffez les animaux sur une plaque chauffante à 37 ° C pendant environ 10 min. Observer les animaux tout en chauffant à reconnaître les signes de surchauffe.
- Resuspendre les monocytes isolés dans les étapes, 1.1- 1.4, dans 150 ul de NaCl, et de charger les cellules dans une seringue de 1 ml à l'insuline avec une aiguille de 30G. Légèrement vortex la solution avant de charger la seringue pour se assurer que tous les monocytes sont injectés. Toujours manipuler les cellules sur de la glace pour éviter l'attachement de chaleur médiation et l'activation des monocytes.
2.2 Retenir
- Éviter de déranger les autres souris dans la cage lors du choix d'une souris pour l'injection intraveineuse.
- Passer la souris dans le dispositif de retenue. Eviter trop de prEssure et être prudent avec les membres postérieurs. (Figure 4)
Remarque: Vous pouvez également utiliser l'anesthésie générale pour garantir sans stress manipulation des animaux. - Assurez-vous que la souris possède un espace pour respirer avant la fermeture du dispositif de retenue.
2.3 Injection
- Désinfecter le site d'injection avec un agent de désinfection. Vaporiser sur la queue de la souris et laisser reposer pendant au moins 1 min.
- Arrêtez veineuse flux sanguin de la queue en appliquant une légère pression sur le côté latéral de la queue au-dessus du site d'injection, pour une meilleure visibilité des veines.
- Mettez la queue de 90 degrés, avant l'injection. (Figure 5)
- Injecter à un angle de 45 degrés. Injecter lentement et pas plus de 5 pi par g pour éviter de nuire animaux.
- Se il ya un blister, qui est un signe d'une injection échoué, cesser immédiatement et répéter l'injection plus proximale.
- Arrêter l'hémorragie sur le côté d'injection en appliquant douce pression pendant environ 1 min.
- A la fin de la procédure, le rétracteur ouvrir et placer la souris dans une cage.
- Observez la souris pendant 20 min pour se assurer que l'animal n'a pas été blessé par l'injection et décubitus sternal est maintenue. Prolonger le délai d'observation jusqu'à ce que la souris reprend conscience suffisante. Retour la souris vers la compagnie d'autres animaux seulement après qu'il a complètement récupéré.
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Representative Results
La solution d'extrait cellulaire de la moelle osseuse murine est constituée de divers types de cellules. Les principaux types de cellules sont des lymphocytes, les granulocytes et les monocytes. Les types de cellules peuvent être estimées par la taille et la granularité, qui est représentée sur la figure 1 pour les deux suspensions indigènes et les cellules récoltées après 5 jours de différenciation. Notez la composition cellulaire pendant la culture itinérante. Cependant, la classification exacte des populations doit se appuyer sur l'expression distinctive de marqueurs cellulaires.
Le marqueur le plus important utilisé pour identifier des cellules du système MPS est-CD115, qui fonctionne comme le récepteur de M-CSF et est spécifiquement exprimé sur les progéniteurs de monocytes, les monocytes et les macrophages. Par conséquent, il pourrait ne pas être utilisé pour identifier MPS-sous-ensembles distincts, mais peut estimer de façon fiable le montant absolu de cellules enfoncés dans la différenciation de monocytes / macrophages. Voir Figure 2 pour un calendrier d'expression CD115 cours différerciation.
Le marqueur de maturité F4 / 80 est utile pour différencier les monocytes mineurs, les monocytes et les macrophages matures. Macrophages montrent une forte expression de F4 / 80 par rapport aux mineurs progéniteurs de monocytes, qui sont négatifs pour le marqueur. Monocytes matures montrent une expression intermédiaire de F4 / 80. Une combinaison de CD115 et F4 / 80 marqueurs représente donc un procédé possible pour la quantification et le suivi de la différenciation des cellules (voir figure 3).
La combinaison de CD115 et F4 / 80 est suffisant pour l'observation de culture de routine et le contrôle qualité avant l'application de cellules. Un examen plus détaillé des monocytes de la moelle osseuse dérivés au jour 5 de la culture confirme leurs propriétés structurelles et fonctionnelles mises en correspondance avec celles des monocytes du sang périphérique 12.
Il est important de fixer la souris avec soin dans le dispositif de retenue, évitant ainsi la tension sur la queue. Restreindre freedom de mouvement le plus possible sans inhiber la respiration pour faciliter l'injection.
Figure 1. Panneau de gauche:. Types cellulaires Composition de types de cellules au jour 1 de la culture incluent lymphocytes, monocytes et granulocytes. Panneau de droite: Notez la composition cellulaire pendant la culture itinérante. population cellulaire comprend monocytes et les macrophages. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Chronologie d'expression CD115 cours de la différenciation. Notez que> 95% de toutes les cellules sont CD115 positif après cinq jours de différenciation, indiquant que la grande majorité des cellules sont soit des monocytes ou des macrophages. La classification peut être basée sur la taille de la cellule et de la granularité, mais marqueurs cellulaires spécifiques sont plus fiables. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Accroître expression de monocytes / macrophages marqueur de maturité F4 / 80. Jour 5: Notez l'apparition d'une population avec l'intermédiaire F4 / 80 expression, qui est compatible avec monocytes phénotype. Jour 7:. Notez le déplacement vers la droite de F4 / 80 expression, compatible avec la maturation des macrophages Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 4. souris fixé au dispositif de retenue pour injection veine de la queue. Après avoir soigneusement retenir la souris, tournez la queue 90 degrés jusqu'à ce que les veines sont visibles sur la face dorsale. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. Coupe schématique de la queue de la souris. L'image illustre l'emplacement des navires dans la queue de la souris. Les artères (rouges) sont situés sur la face ventrale et dorsale, et les veines sont sur le côté latéral de la queue. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous décrivons une méthode simple et rentable pour isoler de grandes quantités de monocytes murins de la moelle osseuse. En comparaison à d'autres protocoles utilisant le sang périphérique, qui obtiennent des rendements de monocytes 5 1.4 x10 6, nous sommes en mesure d'obtenir des rendements plus élevés de 11 x 10 6 ± 3 x 10 6 monocytes d'une souris donateur.
Lors de l'examen des défis avec cette méthode, il est important de mentionner le potentiel de contamination lorsque l'on travaille dans des conditions non stériles. Si le rinçage et les étapes de lavage suivantes ne sont pas suivies correctement, la contamination par des bactéries et des champignons est probable. En outre, la moelle osseuse consiste en des suspensions de cellules hétérogènes, y compris les granulocytes, des lymphocytes et des cellules érythroïdes. Normalement, ces cellules disparaissent entre 2 et 3 jours de culture en raison de l'absence de facteurs de croissance. Après la différenciation des entraînée facteur de croissance, les macrophages sont la principale source de contamination. Pour garder til faible nombre de macrophages et de réduire au minimum la différenciation des monocytes en macrophages, l'utilisation de plaques de fixation ultra-basses et les étapes de lavage mentionnés ci-dessus sont critiques.
Il est difficile d'identifier un marqueur qui est exclusivement spécifique monocytes. L'interférence entre les marqueurs nécessite l'utilisation de plus d'un marqueur, et il existe une variabilité dans la granularité et la taille des cellules dans l'analyse de suspensions de cellules. Les marqueurs et les descriptions figurant dans les figures 1-3 sont de bonnes alternatives pour les types cellulaires représentatives de la culture. Il peut être difficile de distinguer les différents types de cellules, en particulier après jour 5. Il est donc essentiel d'utiliser d'autres marqueurs comme CD115 et F4 / 80.
Compte tenu de l'expansion des cellules de moelle osseuse dans des conditions sans adhérence, la différenciation des macrophages peut être prolongée et les monocytes non différenciés peut se accumuler. la différenciation des macrophages indique une contamination; cependant, due de leur caractère adhésif, même sur des surfaces de culture à très faible fixation, ils peuvent être facilement mis au rebut alors que seulement récolte les cellules non adhérentes de la culture. Dans des expériences antérieures 1,3, la contamination par les macrophages n'a pas conduit à des effets cliniques indésirables graves. Bilan histologique des organes et des muscles de souris après transplantation de cellules a montré que les macrophages injectés assimilés à des organes comme la rate, le foie ou les poumons. L'assimilation des macrophages dans ces organes n'a montré d'effets cliniques observables chez la souris. Le mécanisme moléculaire déclenchée par ces macrophages peut être des questions intéressantes pour d'autres enquêtes.
Les monocytes macrophages ainsi que dans artériogenèse affectent la maladie artérielle périphérique, en particulier lorsqu'ils sont appliqués par voie systémique. Effets secondaires cliniques tels que l'embolie ou une inflammation systémique massif ne ont pas pu être respectées, même après l'injection de plus de 2,5 millions de monocytes, mais ces cellules peuvent déclencher l'inflammation et potiellement provoquer des effets systémiques sévères. Dans les essais humains, ces effets sont susceptibles d'avoir une importance clinique. Le déclenchement de artériogenèse peut affecter la croissance de la tumeur ou la rétinopathie diabétique, et de tels effets systémiques possibles des solutions cellulaires injectés doivent être explorées dans les études futures.
Les publications précédentes 9 décrivent les différences entre les caractéristiques des monocytes de sang et d'os dérivées de la moelle périphériques, ce qui explique pourquoi les propriétés des monocytes de la moelle osseuse peuvent différer de celles isolées à partir de cellules du sang périphérique.
Procédé d'isolement présente un intérêt clinique ainsi. Dessin sang au lieu d'extraire la moelle osseuse humaine est plus pratique dans le cadre de la médecine clinique. Il est important de se occuper du bien-être des animaux et d'appliquer l'analgésie si nécessaire. Pour les injections intraveineuses, il est essentiel à la pratique de manutention à la fois l'animal et la seringue dans le même temps. Si un seul animal subit de multiples injections, la qualité des veines et la peau de la queue souffrent.
Malgré ces inconvénients, cette méthode est très utile pour étudier le comportement et les caractéristiques des monocytes. Les expériences dans le domaine de l'athérosclérose, de l'immunologie et l'inflammation peuvent bénéficier de cette méthode. Seuls 30 min sont nécessaires de l'extraction de moelle osseuse à l'ensemencement de cellules sur des plaques de surface ultra-faible attachement à 6 puits. Les préoccupations éthiques sont minimisés, parce que le rendement élevé de ce protocole minimise le nombre d'animaux nécessaires comme donneurs de cellules. Cette nouvelle méthode sera utile pour de nombreuses études portant sur les monocytes.
Nous avons mis l'accent sur l'augmentation thérapeutique de la croissance des vaisseaux collatéraux par transplantation de monocytes. La nature multifactorielle de ce processus peut expliquer pourquoi seul facteur approches pour des résultats mitigés augmentation de artériogenèse ont générés 13,14. Cela a conduit à l'envestigation de thérapies à base de cellules. Cellules souches et progénitrices dérivées de la moelle osseuse autologue ont été identifiés comme potentiels cellules pour la transplantation, mais seulement des avantages cliniques modérés ont été signalés 15. Outre la recherche sur la posologie, les méthodes d'isolement et voies d'administration, d'autres recherches sont encore nécessaires pour déterminer le type cellulaire optimale. Un inconvénient de la transplantation de cellules autologues pourrait être leur incapacité à activer la réponse immunitaire innée et / ou d'adaptation, et les deux sont essentiels pour artériogenèse. L'augmentation de l'inflammation locale peut représenter le meilleur stimulant pour artériogenèse 16.
L'injection intraveineuse de monocytes est une méthode commune pour la transplantation de cellules dans les modèles de souris si la livraison de médicament systémique est souhaitée. En raison des effets systémiques, les effets secondaires peuvent se produire aussi bien. Assurez-vous que la veine est prévue pour injection. Il est fréquent de confondre les artères et les veines, en particulier lors de l'injection micro très pigmentéee. injection artérielle peut provoquer des embolies, qui conduisent à des problèmes systémiques en circulation.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6-well-ultra-low-attachment plate | Corning Incorporated, NY, USA | 6-well-ultra-low-attachment plate, with cap, sterile | |
| 8- 12 week old, male, balb/c mice | Charles River, Sulzfeld, Germany | ||
| 96-well-plate | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | ||
| Blue dead cell stain | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | ||
| Bovine serum albumine | GE Healthcare, Freiburg, Germany | Fraction V, pH 7.0 | |
| Canules | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 28G, 30G | |
| CD115 | eBioscience, San Diego, USA | 12-1152 | |
| CD11b | eBioscience, San Diego, USA | 53-0112 | |
| Cell culture dish | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | With cap, steril | |
| Centrifuge | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | Allegra® X-15R centrifuge | |
| Depilatory cream | Veet, Mannheim, Germany | ||
| Disinfection agent | Schülke&Mayr GmbH, Norderstedt, Germany | Kodan Tinktur forte | |
| Disposable scalpel No.10 | Feather safety razor Co.Ltd, Osaka, Japan | ||
| EDTA | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Ethanol 96% | Otto Fischar GmbH und Co KG, Saarbrücken, Germany | ||
| Extraction unit Pipetus | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co.KG, Eberstadt, Germany | ||
| F4/80 | AbD Serotec, Düsseldorf, Germany | MCA497APC | |
| FACS buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 0.1% NaN3 | |
| FACS device | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | BD FACS Canto II | |
| FACS tubes | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | ||
| Falcon® pipette | Becton Dickenson Labware, NY, USA | ||
| Fetal calf serum | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Fine forceps | Rubis, Stabio, Switzerland | ||
| Gloves | Rösner-Matby Meditrade GmbH, Kiefersfelden, Germany | ||
| Gr1 | eBioscience, San Diego, USA | 53-5931 | |
| Heating plate | Labotect GmbH, Göttingen, Germany | Hot Plate 062 | |
| Incubator | Ewald Innovationstechnik GmbH, Bad Nenndorf, Germany | Incu safe | |
| Isofluran | Baxter Deutschland GmbH, Unterschleißheim, Germany | ||
| Light microscope | Carl Zeiss SMT GmbH, Oberkochen, Germany | Axiovert 40 °C | |
| Macrophage-Colony Stimulating Factor | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | SRP3110 | |
| Mechanical shaker | IKA, Staufen, Germany | ms2 minishaker | |
| Medium 199 | PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria | Warm in 37 °C water bath before use | |
| Micro test tubes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Microbiological work bench | Thermo Electron, LED GmbH, Langenselbold, Germany | Hera safe | |
| Monocyte wash buffer | Manufactured by our group with single components | PBS, 0.5% BSA, 2 mM EDTA | |
| Mouse restrainer | Various | ||
| NaCl | Berlin Chemie AG, Berlin, Germany | ||
| NaN3 (sodium acide) | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Neubauer counting chamber | Paul Marienfeld GmbH und Co.KG, Lauda-Königshofen, Germany | ||
| Nylon cellsieve | Becton, Dickinson and Company, Franklyn Lakes, New Jersey, USA | Cell strainer, 70 µm mesh size | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma Aldrich, Hamburg, Germany | ||
| Phosphate buffered saline | Life technologies GmbH, Darmstadt, Germany | pH 7.4, sterile | |
| Pipettes | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 10µl/100µl/200µl/1,000µl | |
| Pipetting heads | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | ||
| Serological pipette | Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany | Cellstar 5 ml, 10 ml | |
| Suction unit | Integra bioscience, Fernwald, Germany | Vacusafe comfort | |
| Surgical scissors | Word Precision Instruments, Inc., Sarasota, USA | ||
| Syringe | B. Braun, Melsungen AG, Melsungen, Germany | 1 ml Omnifix® -F insuline syringe | |
| Tubes with cap | Greiner bio one GmbH, Frickenhausen, Germany | 15 ml/50 ml Cellstar tubes | |
| Warm water bath | Julabo Labortechnik GmbH, Seelbach, Germany | Julabo SW22 |
References
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