تقنيات لمعالجة عيون مزروع مع الشبكية الأطراف الاصطناعية للالمترجمة تحليل المرضية: الجزء 2 فوق الشبكي يزرع مع الشبكية المسامير
Summary
Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.
Abstract
Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.
Introduction
التهاب الشبكية الصباغي (RP) هو اضطراب وراثي يسبب فقدان واسعة النطاق من المستقبلات الضوئية، وهي الخلايا في الطبقة الخارجية للشبكية المسؤولة عن transducing الضوء، في شكل فوتونات، في النشاط العصبي. الأهم من ذلك، المرضى الذين يعانون من RP وعادة ما يكون الخلايا العصبية المتبقية في طبقات أخرى من الشبكية الخاصة بهم والتي لا تزال وظيفية. الاصطناعية الشبكية قادرة على استعادة بعض الرؤية المحدودة لهؤلاء المرضى من خلال استهداف هذه الخلايا العصبية على قيد الحياة مع التحفيز الكهربائي لتنشيط لهم طريقا 1،2 البصري. نتائج الإدراك الحسي من التجارب السريرية قد أظهرت نتائج واعدة في وقت مبكر، ومؤخرا وقد تمت الموافقة على بعض الأجهزة للاستخدام التجاري. حاليا، هناك ثلاثة مواقع رئيسية التشريحية التي تم فيها وضع الاصطناعية الشبكية السريرية: epiretinally 3،4، 5،6 subretinally وsuprachoroidally 7،8. أجهزة مختلفة تستخدم مواد مختلفة وتخصيصها شكلهاإلى الموقع الذي يتم فيه زرع فيها. ومع ذلك، وأنهم جميعا خلق التعاليم البصرية من خلال تفعيل الخلايا العصبية المتبقية من شبكية العين مع النبضات الكهربائية.
هناك احتمال لأي بدلة طبي لتلف الأنسجة المحيطة بسبب الآثار الميكانيكية للوضع الأولي أو قوات الجارية لاحقة. في حالة التحفيز والتشجيع التي تزرع في الجسم، مثل الأطراف الاصطناعية في شبكية العين، وهناك اعتبار آخر ينبغي أن يكون المعلمات الكهربائية ضمن حدود آمنة. سلامة المرضى أمر بالغ الأهمية، لذلك يجب أن تكون الأجهزة اختبارات صارمة في الدراسات قبل السريرية قبل التقدم إلى وضع السريرية 9-15. في المادة مصاحب لدينا، وصفنا طريقة لتقييم التشريح المرضي المترجمة من العين المحيطة زرع المتمركزة في الفضاء suprachoroidal 16. في هذا المخطوط، وصفنا تقنية لتصور الأنسجة المحيطة بالعين مجموعة القطب علق على شبكية العين epiretinally، في ما قبل السريرية (FEالخط) نموذج (الشكل 1).
الموقع فوق الشبكي هو الموقف الأكثر استخداما عادة لتحديد مكان بدلة البصرية. وعادة ما تلصق صفائف الكهربائي تقع هنا لشبكية العين مع تك المعدنية التي تخترق جميع طبقات العين 17-20. قبل الأساليب المذكورة في المخطوطة الحالية، كان من الصعب إجراء تقييم دقيق لشبكية العين والأنسجة الأخرى المحيطة بها على الفور تك. أدى تثبيت العين قياسي باستخدام الفورمالين محايدة مخزنة في الضرر الشبكية مصطنعة بسبب الحركة التفاضلية للشبكية العين والصلبة ضد نقطة ثابتة من نقطة معلمة. لذلك أي ضرر الفعلي الناجم عن معلمة ومجموعة فوق الشبكي لا يمكن مراعاته بدقة. وبالإضافة إلى ذلك، باجتزاء الأنسجة العين لا يمكن أن يؤديها مع تك الشبكية في الموقع كما أجسام معدنية لا يمكن أن تقطع بسهولة مع جهاز النسيجي التقليدي؛ إزالة تك قبل أن معالجة النسيجي أيضاغير مرغوب فيه لأن هذا أدى أيضا إلى تلف شبكية العين مصطنعة.
وكان الهدف من هذه الدراسة ذات شقين: 1) للحد من انفصال الشبكية الحرفية بحيث أن أي الأضرار الناجمة عن تك ومجموعة زرع فوق الشبكي يمكن تقييم موثوقة. و2) لتصور بنية شبكية العين المجاورة لنقطة معلمة دون إزالته. من أجل تحقيق الهدف 1، وقد استخدمت تقنية التثبيت الجديدة (كما هو موضح في المادة رفيق 16)، مما يقلل من التبطين الشبكية مصطنعة. من أجل تحقيق الهدف 2، وتعديل والتضمين، وطحن، وتلميع التقنية، وضعت أصلا لمراقبة الموقع من الأقطاب الكهربائية زرع قوقعة 21-23 في. الطرق الموضحة في هذه المخطوطة تسمح التصور من شبكية العين المحيطة والمجاورة لنقطة معلمة في الموقع مع تقليل الضرر الشبكية مصطنعة وبالتالي السماح للتقييم دقيق من أي ضرر محتمل قد يسببها تك ومجموعة فوق الشبكي.
Protocol
Representative Results
Discussion
التقنيات القياسية النسيجية غير قادرة على معالجة يزرع المعادن الصلبة في الموقع نظرا للقيود في قطع هذه الكائنات مع المعادن والزجاج أو حتى ريش الماس. في ورقتنا الرفيق 16، أظهرنا أن استخدام كلها العين تقنية تثبيت تعديل يمكن أن تقلل التبطين الشبكية مصطنعة. في المخطوطة الحالية، وهي المنشأة طحن وتلميع تقنية لتصور زراعة قوقعة تم تعديل 21-23 في الموقع لأطراف اصطناعية في شبكية العين. وتك التيتانيوم، وتستخدم لتأمين مجموعة الكهربائي لشبكية العين، epiretinally، كان جزءا لا يتجزأ من الايبوكسي جنبا إلى جنب مع أنسجة العين المحيطة بها. ثم تم الموجهة هذه الكتلة الراتنج مناسب والأرض تدريجيا / مصقول من أجل الكشف عن التشكل الأنسجة متاخم لتك المعدنية. واتخذت صورة من سطح مصقول من كتلة على أعماق مختلفة مع المجهر تشريح قوية. هذه التقنية مفيدة لل: تصور وevaluatجي استجابة الأنسجة المجاورة للزرع فوق الشبكي. لتقييم الصدمة الجراحية المرتبطة زرع الزرع. لتحديد رد الفعل البيولوجي إلى المكونات المعدنية الصلبة. وقياس المسافة بين الزرع وسطح الشبكية.
هذه التقنية سوف يكون مفيدا في دراسات السلامة المستقبلية لتصور الوضع الطبيعي في المنطقة المجاورة لنقطة معلمة في شبكية العين أو صلبة أخرى (على سبيل المثال، لامع) الكائنات في العين في. وهذا له التطبيق المباشر في تقييم السلامة قبل السريرية الأطراف الصناعية علق على شبكية العين epiretinally. قد يكون من المفيد لتقييم تلف الأنسجة في مناطق الشبكية في اتصال مع يزرع تقع في الموقع الفرعي في شبكية العين أيضا.
هناك عدة طرق للتحقق من أن قد تم تنفيذ هذه التقنية بشكل صحيح. في كل مرحلة، وشبكية العين يجب أن تظل تعلق على الطبقات الخارجية للعين. إذا كان هناك الجسيمة انفصال الشبكية مصطنعة، وهذا قد الهنديةأكلت مشكلة مع تثبيت. عندما يتم جزءا لا يتجزأ من العينة وإعادة الموجه في الراتنج النهائي منع الشبكية يجب أن تكون قريبة من متعامد مع وجه طحن من كتلة. هذا سيقلل القطع المائل. ومن المفيد للتأكد من أن عدد من الخطوات الإضافية طحن (من المعروف حجم الخطوة) المطلوبة لاجتياز كائن (مثل تك في شبكية العين) وفقا لذلك ترتبط مع أبعاد الكائن.
يمكن أن يكون الأمثل للتقنية في عدة طرق. يمكن الحد من الخدوش على سطح كتلة الايبوكسي المرتبطة بعملية طحن مع تدريجية تلميع الصف الدقيقة. لهذه الدراسة، استخدمنا 800، 1000، 1200، 2400، و 4000 ورقة كربيد السيليكون الصف. ويمكن أيضا أن تستخدم معجون الماس لتحسين الانتهاء من السطح. والانتهاء من السطح أدق يعطي صورة ذات جودة أعلى ولكن على حساب من الزمن تلميع إضافية. وهناك اعتبار آخر بالغ الأهمية لتحسين نتائج هذه التقنية هو الخيار ونوعية أوبتيخدمات العملاء والإضاءة تستخدم لالتقاط الصور. غيرها من البقع النسيجية الأساسية – وخاصة البقع نيسل، ويمكن استخدامها في مكان طولويدين الأزرق، ولكن قد تحتاج إلى مزيد من التحسين. وبعض البقع وصمة عار الراتنج وكذلك الأنسجة (على سبيل المثال، يوزين)، لذلك البولندية الضحلة قد تكون هناك حاجة بعد تلطيخ لإزالة تغيير اللون الخلفية. البقع المتخصصة، والأصباغ الفلورية وتلطيخ المناعى لم يحاول، ولكن ما لم يكن هو المطلوب نتيجة محددة جدا، والوقت اللازم لتنفيذ هذه البقع في كل مستوى طحن من المرجح أن تكون باهظة. ومع ذلك، قد يكون من الممكن وصمة عار على الأنسجة ككل قبل الخطوة تضمينها (الخطوة 3.4) 24.
القيد الرئيسي لهذا الأسلوب هو أنه بمجرد ارضيه المنطقة ذات الاهتمام بعيدا، فإنه لا يمكن استرجاع، وبالتالي، فإنه من الحكمة للقبض على العديد من (ربما زائدة عن الحاجة) الصور في مجموعة متنوعة من تكبير في كل مرحلة من طحن وتلميع. ومنأيضا من المهم أن تستخدم زيادات صغيرة لكل تعديل عمق طحن. الحد آخر من هذه التقنية هو أن من التكبير البصري وحل مقارنة مع الأنسجة التي شنت على شريحة زجاجية وعرضها مع معيار (انتقال) المجهر الضوئي. لأغراض النماذج وتقييم سلامة جهاز زرع الرواية، وتقييم المرضية الإجمالي هو من مصلحة الأولية. توفر هذه التقنية وسيلة فعالة لرصد الأضرار ذات الصلة سريريا المرتبطة تك في شبكية العين. مع الممارسة، والوقت الكلي المطلوب لجمع طحن، وتلميع وتصوير عينة معينة (مرة واحدة جزءا لا يتجزأ) مشابه للوقت الذي سيستغرقه القسم كتلة البارافين أو القسم المجمدة.
وهناك أيضا إمكانية لتقنيات الحالية إلى أن تمتد إلى التطبيقات خارج نطاق زراعة شبكية العين. يناسب هذه التقنية لتقييم الأنسجة المجاورة لزرع الصلب، حيث استخراج زرع ليس feasibسوف جنيه أو تلف الواجهة. على سبيل المثال، هذه التقنية يمكن توسيعها لتقييم يزرع مصنوعة من المعدن (على سبيل المثال، البلاتين، الننتول، الخ) التي لا يمكن قطع مع التقنيات النسيجية التقليدية، مثل بعض الدماغ العميق أو أقطاب الأعصاب الطرفية، حقنة عادية لتسليم المخدرات، الدعامات الأوعية الدموية أو الاصطناعية العظام.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support.
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z):
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.
Materials
| Name of the reagent / equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Acetone | Chem-Supply | AA008 | Propanone BHD Medical grade |
| Epo-Tek 301 Epoxy | Epoxy Technology | Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0 | |
| Ethanol 70-75% v/v | Merck PTY LTD | 4.10261 | Alcohol |
| Ethanol | Merck PTY LTD | 90143 | Alcohol |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| TegraPol grinding/polishing machine | Struers | TegraPol-25 | |
| AccuStop specimen holder | Struers | Accustop | |
| Light microscope | Leica | MZ16 | |
| Objective lens | Leica | 2.0x Planapo Objective | |
| Digital Microscope Camera | Leica | DFC-420C | |
| Microscope Software | Leica | Application Suite v4.1.0 |
References
- Shepherd, R. K., Shivdasani, M. N., Nayagam, D. A., Williams, C. E., Blamey, P. J. Visual prostheses for the blind. Trends Biotechnol. 31, 562-571 (2013).
- Santos, A., et al. Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).
- Humayun, M. S., et al. Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis. Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).
- Roessler, G., et al. Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).
- Chow, A. Y., et al. The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).
- Zrenner, E., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. Proc Biol Sci. 278, 1489-1497 (2011).
- Fujikado, T., et al. Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 4726-4733 (2011).
- Saunders, A. L., et al. Development of a surgical procedure for implantation of a prototype suprachoroidal retinal prosthesis. Clin Experiment Ophthalmol. , (2013).
- Lee, S. W., et al. Development of microelectrode arrays for artificial retinal implants using liquid crystal polymers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5859-5866 (2009).
- Sakaguchi, H., et al. Transretinal electrical stimulation with a suprachoroidal multichannel electrode in rabbit eyes. Jpn J Ophthalmol. 48, 256-261 (2004).
- Majji, A. B., et al. Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).
- Walter, P., et al. Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits. Retina. 19, 546-552 (1999).
- Ray, A., Chan, L., Thomas, B., Weiland, J. D. Effects of prolonged stimulation at the electrode-retina interface. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 1285-1287 (2006).
- Colodetti, L., et al. Pathology of damaging electrical stimulation in the retina. Experimental eye research. 85, 23-33 (2007).
- Nayagam, D. A. X., et al. Chronic Electrical Stimulation with a Suprachoroidal Retinal Prosthesis: A Preclinical Safety and Efficacy Study. PLoS One. 9, e97182 (2014).
- Nayagam, D. A. X., et al. Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50411 (2013).
- Laube, T., et al. Development of surgical techniques for implantation of a wireless intraocular epiretinal retina implant in Gottingen minipigs. Graefe’s Archive For Clinical And Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 250, 51-59 (2012).
- Gerding, H., et al. Successful long-term evaluation of intraocular titanium tacks for the mechanical stabilization of posterior segment ocular implants. Mat.-wiss. u. Werkstofftech. 32, 903-912 (2001).
- Seo, J. -. M., et al. Silicon retinal tack for the epiretinal fixation of the polyimide electrode array. Current Applied Physics. 6, 649-653 (2006).
- Hadjinicolaou, A. E., et al. Electrical stimulation of retinal ganglion cells with diamond and the development of an all diamond retinal prosthesis. Biomaterials. 33, 5812-5820 (2012).
- Briggs, R. J., et al. Comparison of round window and cochleostomy approaches with a prototype hearing preservation electrode. Audiol Neurootol. 11, 42-48 (2006).
- Shepherd, R., et al. An improved cochlear implant electrode array for use in experimental studies. Hear Res. 277, 20-27 (2011).
- Tykocinski, M., et al. Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays. Am J Otol. 21, 205-211 (2000).
- Hardie, N. A., MacDonald, G., Rubel, E. W. A new method for imaging and 3D reconstruction of mammalian cochlea by fluorescent confocal microscopy. Brain Res. 1000, 200-210 (2004).
