Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.
Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.
Retinitis pigmentosa (RP) er en arvelig lidelse, der forårsager omfattende tab af fotoreceptorer, som er de celler i det yderste lag af nethinden er ansvarlig for transduktion af lys i form af fotoner, i neural aktivitet. Vigtigere er det, patienter med RP typisk resterende neuroner i andre lag af nethinden, som er stadig funktionel. Retinale proteser er i stand til at genoprette en vis begrænset udsyn til disse patienter ved at målrette disse overlevende neuroner med elektrisk stimulation til at aktivere deres visuelle pathway 1,2. Sanselig resultater fra kliniske forsøg har vist lovende tidlige resultater og for nylig nogle enheder er blevet godkendt til kommerciel brug. I øjeblikket er der tre væsentlige anatomiske steder, hvor kliniske retinale proteser er placeret: epiretinally 3,4, subretinalt 5,6 og suprachoroidally 7,8. Forskellige enheder anvender forskellige materialer og deres form, er tilpassettil det sted, hvor de er implanteret. Men de alle skabe visuelle percepter ved at aktivere de resterende neuroner i nethinden med elektriske impulser.
Der er potentiale for en medicinsk protese at skade omkringliggende væv som følge af mekanisk virkning af den oprindelige placering eller efterfølgende igangværende kræfter. I tilfælde af implanterbare stimulatorer, såsom retinale proteser, der er den yderligere betragtning, at de elektriske parametre bør være inden for sikre grænser. Patientsikkerhed er altafgørende, så enheder skal være grundigt testet i prækliniske studier, før videre til en klinisk indstilling 9-15. I vores følgesvend artiklen, beskrev vi en metode til at vurdere den lokaliserede histopatologi af øjet der omgiver et implantat placeret i suprachoroidale rum 16. I den foreliggende manuskript, beskriver vi en teknik til visualisering af øjenvæv omgiver en elektrodesæt hæftet til nethinden epiretinally i en præklinisk (Felinje) model (figur 1).
Den Epiretinal placering er den mest almindeligt anvendte position til lokalisering af en visuel protese. Elektrodesæt beliggende her er typisk fastgjort til nethinden med en metal tack som trænger alle lag i øjet 17-20. Forud for de teknikker, der er beskrevet i den foreliggende manuskript, var det vanskeligt nøjagtigt at vurdere retinal og andre væv, der omgiver en tack. Standard øje fiksering ved hjælp af neutral bufret formalin resulterede i kunstig retinal skade som følge af forskellen bevægelse af nethinden og senehinden mod det faste punkt i tack. Derfor nogen egentlig skade som følge af kurs og Epiretinal matrix kunne ikke nøjagtigt overholdes. Desuden kunne sektionering øjenvævet ikke udføres med retinal tack in situ som metalgenstande ikke let kan skæres med traditionelle histologiske apparat; fjerne tack før histologiske behandling var ogsåuønsket, da det førte også til kunstig retinal skade.
Formålet med denne undersøgelse var dobbelt: 1) at reducere nethindeløsning artefakt, så skader forårsaget af kurs og den Epiretinal implantat matrix kan opgøres pålideligt vurderes; og 2) at visualisere retinal arkitektur støder op til tack uden at fjerne det. For at opnå mål 1 blev en ny fiksering anvendte teknik (som beskrevet i den ledsagende artikel 16), hvilket reducerer artefakter retinal delaminering. For at opnå målet 2, modificerede vi en indlejring, slibning og polering teknik, der oprindeligt blev udviklet til in situ overvågning af cochlear implant elektroder 21-23. Beskrevet i dette manuskript metoder tillader visualisering af nethinden omkring og støder op til en kurs på stedet og samtidig minimere kunstig retinal skader og derfor giver præcis vurdering af eventuelle skader forårsaget af kurs og Epiretinal array.
Standard histologiske teknikker ikke er i stand til at behandle hårdt metal implantater i stedet på grund af begrænsninger i at skære disse objekter med metal, glas eller endog diamantklinger. I vores companion papir 16 viste vi, at anvendelsen af en modificeret hel-eye fiksering teknik kan reducere kunstig retinal delaminering. I den nuværende manuskript, der er etableret en slibning og polering teknik til visualisering cochlear implantater 21-23 in situ blev modificeret til retinale proteser. En titan tack, anvendes til at sikre en elektrodesæt til nethinden, epiretinally blev indlejret i epoxy sammen med det omgivende øjenvæv. Denne harpiks blok blev derefter orienteret korrekt og gradvist jord / poleret for at afsløre vævsmorfologi umiddelbart op til metallet tack. Billeder af den polerede overflade af blokken i forskellige dybder blev taget med en kraftig dissektion mikroskop. Denne teknik er nyttig til: visualisere og evaluating vævet reaktion støder op til Epiretinal implantat; at vurdere den kirurgiske traume associeret med implantation af implantatet; at bestemme den biologiske reaktion på hårdt metal; og at måle afstanden mellem implantatet og overfladen af nethinden.
Denne teknik vil være nyttigt i fremtidige sikkerhedsundersøgelser til in situ visualisering af regionen støder op til en retinal tack eller andre hårde (fx metallisk) objekter i øjet. Dette har direkte anvendelse ved vurderingen af prækliniske sikkerhed af proteser tidsmæssigt til nethinden epiretinally. Det kan også være nyttige til evaluering af vævsskade i retinale regioner i kontakt med implantater placeret i sub-retinal placering.
Der er flere måder at kontrollere, at teknikken er blevet udført korrekt. På hvert trin skal nethinden forblive fastgjort til de ydre lag af øjet. Hvis der er grov kunstig nethindeløsning, kan dette indiskspiste et problem med fiksering. Når prøven er indlejret og re-orienteret i den endelige harpiks blokere nethinden bør være tæt på vinkelret med slibning ansigt af blokken; dette vil minimere skrå skæring. Det er nyttigt at kontrollere, at antallet af enkeltprøver slibning trin (med kendt trin), der skal til at krydse en genstand (såsom en retinal tack) korrelerer derfor med dimensionerne af objektet.
Teknikken kan optimeres på flere måder. Ridser på overfladen af epoxy blok er forbundet med slibeprocessen kan reduceres med gradvis finere kvalitet polering. For nærværende undersøgelse, brugte vi 800, 1000, 1200, 2400, og 4000 siliciumcarbid papir. Diamant pasta kan også bruges til at forbedre overfladekvalitet. En finere overfladefinish giver et billede af højere kvalitet, men på bekostning af ekstra polering tid. En anden kritisk overvejelse for at forbedre resultatet af denne teknik er valget og kvaliteten af optics og belysning bruges til billedoptagelse. Andre grundlæggende histologiske pletter – især Nissl pletter, kan anvendes i stedet for toluidinblå, men kan kræve yderligere optimering. Nogle pletter vil plette harpiksen samt væv (f.eks Eosin) derfor en lavvandet polish kan være påkrævet efter farvning for at fjerne baggrund misfarvning. Specialiserede pletter, fluorescerende farvestoffer og immunhistokemisk farvning blev ikke forsøgt, men medmindre et meget specifikt resultat ønskes, den nødvendige tid til at udføre disse pletter på hver slibning niveau vil sandsynligvis være uoverkommelige. Det kan imidlertid være muligt at plette væv som en helhed, før indlejring (trin 3.4) 24.
Den største begrænsning ved denne teknik er, at når området af interesse er blevet slebet væk, det kan ikke hentes, derfor er det klogt at fange mange (eventuelt overflødige) billeder på en række forstørrelser på hvert trin af slibning og polering. Det erogså vigtigt at bruge små trin for hver slibning dybdejustering. En anden begrænsning ved denne teknik er, at den optiske forstørrelse og opløsning sammenlignet med væv monteret på et objektglas og ses med en standard (transmission) lysmikroskop. Med henblik på prototyping og vurdere sikkerheden ved en ny implantat-enhed, brutto patologisk vurdering er af primær interesse. Denne teknik tilvejebringer en effektiv metode til iagttagelse klinisk relevant skade forbundet med en retinal tack. Med praksis, den samlede tid, der kræves til at indsamle sliber, polerer og fotografere en given prøve (når indlejret) er sammenlignelig med den tid, det ville tage at afsnittet en paraffin blok eller frosset sektion.
Der er også potentialet for de nuværende teknikker udvides til anvendelser uden for omfanget af retinale implantater. Denne teknik er velegnet til evaluering af væv støder op til en hård implantat, hvor implantatet ekstraktion er ikke feasible eller vil skade grænsefladen. For eksempel kan denne teknik udvides til at evaluere implantater fremstillet af metal (f.eks platin, nitinol, etc.), der ikke kan skæres med konventionelle histologiske teknikker, såsom nogle dybe hjerne eller perifere nerve elektroder, kanyler for drug delivery, vaskulære stents eller ortopædiske proteser.
The authors have nothing to disclose.
Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support.
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z):
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.
Name of the reagent / equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Acetone | Chem-Supply | AA008 | Propanone BHD Medical grade |
Epo-Tek 301 Epoxy | Epoxy Technology | Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0 | |
Ethanol 70-75% v/v | Merck PTY LTD | 4.10261 | Alcohol |
Ethanol | Merck PTY LTD | 90143 | Alcohol |
Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
Ethylenediamine Tetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | ||
TegraPol grinding/polishing machine | Struers | TegraPol-25 | |
AccuStop specimen holder | Struers | Accustop | |
Light microscope | Leica | MZ16 | |
Objective lens | Leica | 2.0x Planapo Objective | |
Digital Microscope Camera | Leica | DFC-420C | |
Microscope Software | Leica | Application Suite v4.1.0 |