טכניקות לעיני עיבוד מושתלים בתותב רשתית למותאם למקום Histopathological ניתוח: חלק 2 Epiretinal שתלים עם נעצי רשתית
Summary
Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.
Abstract
Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.
Introduction
רטיניטיס פיגמנטוזה (RP) הוא הפרעה תורשתית הגורמת לאובדן נרחב של קולטני אור, שהם התאים בשכבה החיצונית של הרשתית אחראית על transducing אור, בצורה של פוטונים, לפעילות עצבית. חשוב לציין, בחולים עם RP בדרך כלל יש נוירונים שיורית בשכבות האחרות של הרשתית שלהם שעדיין פועל. תותבות רשתית הן מסוגלות להחזיר כמה ראייה מוגבלת לחולים אלו על ידי מיקוד הנוירונים ששרדו אלה עם גירוי חשמלי כדי להפעיל 1,2 מסלול הראייה שלהם. תוצאות תפיסתי ממחקרים קליניים הראו מבטיחות תוצאות מוקדמות ולאחרונה כמה מכשירים שאושרו לשימוש מסחרי. נכון לעכשיו, יש שלושה מקומות עיקריים אנטומיים בי תותבות רשתית קליניות הוצבו: epiretinally 3,4, subretinally 5,6 וsuprachoroidally 7,8. התקנים שונים עושים שימוש בחומרים שונים וצורתם מותאמתלמיקום שבו הם מושתלים. עם זאת, כולם ליצור תפיסות חזותיות על ידי הפעלת תאי העצב שיורית של הרשתית עם פולסים חשמליים.
יש פוטנציאל לכל תותבת רפואית לניזק לרקמות עקב השפעות מכאניות של המיקום הראשוני או כוחות מתמשכים שלאחר מכן. במקרה של גירוי מושתל, כמו תותבות רשתית, יש שיקול נוסף שהפרמטרים החשמליים צריכים להיות בגבולות בטוחים. בטיחות מטופל היא בעל חשיבות עליונה, ולכן התקנים חייבים להיבדק בקפדנות במחקרים פרה-קליניים לפני קידום להגדרה קליני 9-15. במאמר הנלווה שלנו, שתארנו שיטה להערכת histopathology המקומי של העין סביב שתל ממוקם בחלל suprachoroidal 16. בכתב היד הנוכחית, אנו מתארים טכניקה המאפשרת הדמיה של רקמות העין שמסביב מערך אלקטרודות המודבק על הרשתית epiretinally, בפרה-קליני (Feמודל קו) (איור 1).
מיקום epiretinal הוא העמדה מנוצל בדרך כלל לאיתור תותב חזותית. מערכי אלקטרודה ממוקמים כאן הם מודבקים בדרך כלל לרשתית עם נקודת סימון מתכת שחודרת את כל השכבות של העין 17-20. לפני הטכניקות מתוארות בכתב היד הנוכחי, זה היה קשה להעריך את הרשתית ורקמות אחרות המקיפות את נקודת סימון מייד במדויק. קיבעון עין סטנדרטי באמצעות ניטראלי שנאגרו פורמלין גרם לנזק ברשתית artifactual בשל תנועת ההפרש של הרשתית ולובן העין נגד נקודת סימון הקבוע. לכן כל נזק ממשי שנגרם על ידי סימון ומערך epiretinal לא יכול להיות שנצפה בצורה מדויקת. בנוסף, חתך ברקמת העין לא יכול להתבצע עם נקודת סימון הרשתית באתר כחפצי מתכת לא ניתן לחתוך בקלות עם מנגנון היסטולוגית מסורתי; הסרת סימון לפני עיבוד היסטולוגית היה גםלא רצוי כמו זה גם הוביל לנזק ברשתית artifactual.
מטרת המחקר הנוכחי הייתה כפולה: 1) כדי להפחית artefact היפרדות הרשתית, כך שכל נזק שייגרם על ידי סימון ומערך שתל epiretinal ניתן להעריך באופן מהימן; ו -2) כדי להמחיש את ארכיטקטורת הרשתית סמוכה לנקודת סימון מבלי להסיר אותו. על מנת להשיג מטרת 1, טכניקת קיבעון חדשה נוצלה (כפי שמתוארת במאמר הנלווה 16), אשר מפחית delamination רשתית artifactual. על מנת להשיג מטרה 2, אנחנו שונה הטבעה, טחינה, וליטוש טכניקה, שפותחה במקור עבור בתצפית באתרו של אלקטרודות שתל שבלול 21-23. השיטות שתוארו בכתב היד הזה מאפשרים הדמיה של הרשתית מסביב ובצמוד לנקודת סימון באתר תוך מזעור נזק לרשתית artifactual ולכן מאפשר הערכה מדויקת של כל נזק פוטנציאלי שנגרם על ידי סימון ומערך epiretinal.
Protocol
Representative Results
Discussion
טכניקות היסטולוגית סטנדרטיים איננו יכולות לעבד את שתלי מתכת קשים באתר בשל מגבלות בחיתוך אובייקטים אלה עם מתכת, זכוכית או אפילו להבי יהלום. נייר הלוויה שלנו 16, הראה שהשימוש בטכניקת קיבוע כל-עין שונה יכול להפחית delamination רשתית artifactual. בכתב היד הנוכחית, טחינה הוקמה וליטוש טכניקה המאפשר הדמיה שתלי שבלול 21-23 באתר שונה לתותבות רשתית. נקודת סימון טיטניום, המשמש לאבטחת מערך אלקטרודות לרשתית, epiretinally, הייתה מוטבע באפוקסי יחד עם רקמות העין שמסביב. בלוק שרף אז זה היה מכוון כראוי וקרקע בהדרגה / מלוטש כדי לחשוף את מורפולוגיה הרקמה מייד בסמוך לנקודת סימון המתכת. תמונות של פני השטח המלוטשים של הגוש בעומקים שונים צולמו עם מיקרוסקופ לנתיחה חזק. טכניקה זו שימושית עבור: חזותי וevaluating תגובת הרקמות סמוכה לשתל epiretinal; כדי להעריך את הטראומה הניתוחית הקשורים בהשתלה של השתל; כדי לקבוע את התגובה הביולוגית לרכיבי מתכת קשים; ולמדוד את המרחק בין השתל ואת פני השטח של הרשתית.
טכניקה זו תהיה שימושית בעתיד מחקרי בטיחות בהדמיה באתרו של האזור הסמוך לנקודת סימון רשתית או (לדוגמא, מתכתי) חפצים אחרים קשים בעין. זו יש יישום ישיר בהערכת הבטיחות פרה-קלינית של תותבות מודבקות על הרשתית epiretinally. זה יכול להיות גם שימושי להערכת נזק לרקמות באזורי רשתית במגע עם שתלים ממוקמים במיקום תת-רשתית.
ישנן מספר דרכים כדי לוודא שהטכניקה שבוצעה כהלכה. בכל שלב, הרשתית צריכה להישאר מחובר אל השכבות החיצוניות של העין. אם יש היפרדות רשתית artifactual ברוטו, זה עשוי הודיאכל בעיה עם הקיבעון. כאשר המדגם הוא משובץ ומחדש חוקיים בשרף הסופי לחסום את הרשתית צריך להיות קרוב למאונכים עם-טחינת הפנים של הבלוק; זה יהיה למזער חיתוך אלכסוני. כדאי לבדוק שמספר צעדי שחיקה מצטברים (של גודל צעד ידוע) נדרש לעבור אובייקט (כגון סימון ברשתית) לתאם בהתאם לממדים של האובייקט.
הטכניקה יכולה להיות מותאמת בכמה דרכים. סריטות על פני השטח של בלוק אפוקסי הקשורים בתהליך שחיקה יכולות להיות מופחתות עם ליטוש עדין כיתה בהדרגה. לצורך המחקר הנוכחי, השתמשנו 800, 1000, 1200, 2400, 4000 ונייר סיליקון קרביד הכיתה. להדביק יהלומים יכולים לשמש גם כדי לשפר את לסיים את פני השטח. לסיים את פני השטח עדינים נותן תמונה באיכות גבוהה אך במחיר של זמן ליטוש נוסף. שיקול מרכזי נוסף לשיפור התוצאה של טכניקה זו הוא הבחירה והאיכות של optics ותאורה המשמשים ללכידת התמונה. כתמים אחרים בסיסיים היסטולוגית – במיוחד כתמי Nissl, ניתן להשתמש במקום של toluidine כחול, אבל עשוי לדרוש אופטימיזציה נוספת. כתמים מסוימים להכתים את השרף, כמו גם את הרקמות (למשל, Eosin), ולכן ייתכן שיהיה צורך פולני רדוד לאחר הצביעה כדי להסיר discolouration רקע. כתמים המתמחים, צבעי ניאון והמכתים immunohistochemical לא ניסו, אבל אם תוצאה מאוד ספציפית היא רצויה, הזמן הנדרש לביצוע כתמים אלה בכל רמה שחיקה עשוי להיות מונע. עם זאת, ייתכן שניתן להכתים את הרקמה כולה לפני שלב ההטבעה (שלב 3.4) 24.
המגבלה העיקרית של שיטה זו היא שברגע שהאזור של עניין כבר השחיז, לא ניתן יהיה לאחזר אותו, ולכן, זה נבון כדי ללכוד תמונות רבות (אולי מיותר) במגוון רחב של הגדלה בכל שלב של השחזה וליטוש. זהחשוב גם להשתמש במרווחים קטנים עבור כל התאמת עומק שחיקה. מגבלה נוספת של שיטה זו היא ששל הגדלה האופטית ורזולוציה בהשוואה לרקמה רכובה על שקופיות זכוכית ונצפתה עם מיקרוסקופ רגיל (שידור) אור. לעניין prototyping והערכת הבטיחות של מכשיר שתל רומן, ההערכה פתולוגית ברוטו היא עניין עיקרי. טכניקה זו מספקת שיטה יעילה להתבוננות נזק רלוונטי קליני הקשורים לנקודת סימון רשתית. בעזרת תרגול, הזמן הכולל הנדרש כדי לאסוף לטחון, פולני ולצלם דגימה נתון (מוטבעת פעם אחת) הוא דומה לזמן שייקח לסעיף בלוק פרפין או סעיף קפוא.
יש גם פוטנציאל לטכניקות הנוכחיות ליוארך ליישומים מחוץ להיקף של שתלי רשתית. טכניקה זו מתאימה להערכת הרקמה סמוכה לשתל קשה, שבו הפקת שתל היא לא feasible או יפגע בממשק. לדוגמא, טכניקה זו יכולה להיות מורחבת כדי להעריך שתלים עשויים ממתכת (לדוגמא, פלטינה, ניטינול, וכו ') שלא ניתן לחתוך עם טכניקות היסטולוגית קונבנציונליות, כגון כמה מוח עמוק או אלקטרודות עצבים היקפיים, cannulae עבור משלוח סמים, סטנטים כלי דם או שתלים אורתופדיים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support.
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z):
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.
Materials
| Name of the reagent / equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Acetone | Chem-Supply | AA008 | Propanone BHD Medical grade |
| Epo-Tek 301 Epoxy | Epoxy Technology | Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0 | |
| Ethanol 70-75% v/v | Merck PTY LTD | 4.10261 | Alcohol |
| Ethanol | Merck PTY LTD | 90143 | Alcohol |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| TegraPol grinding/polishing machine | Struers | TegraPol-25 | |
| AccuStop specimen holder | Struers | Accustop | |
| Light microscope | Leica | MZ16 | |
| Objective lens | Leica | 2.0x Planapo Objective | |
| Digital Microscope Camera | Leica | DFC-420C | |
| Microscope Software | Leica | Application Suite v4.1.0 |
References
- Shepherd, R. K., Shivdasani, M. N., Nayagam, D. A., Williams, C. E., Blamey, P. J. Visual prostheses for the blind. Trends Biotechnol. 31, 562-571 (2013).
- Santos, A., et al. Preservation of the inner retina in retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol. 115, 511-515 (1997).
- Humayun, M. S., et al. Visual perception in a blind subject with a chronic microelectronic retinal prosthesis. Vision Res. 43, 2573-2581 (2003).
- Roessler, G., et al. Angiographic findings folowing tack fixation of a wireless epiretinal retina implant device in blind RP patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 249, 1281-1286 (2011).
- Chow, A. Y., et al. The artificial silicon retina microchip for the treatment of vision loss from retinitis pigmentosa. Arch Ophthalmol. 122, 460-469 (2004).
- Zrenner, E., et al. Subretinal electronic chips allow blind patients to read letters and combine them to words. Proc Biol Sci. 278, 1489-1497 (2011).
- Fujikado, T., et al. Testing of semichronically implanted retinal prosthesis by suprachoroidal-transretinal stimulation in patients with retinitis pigmentosa. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, 4726-4733 (2011).
- Saunders, A. L., et al. Development of a surgical procedure for implantation of a prototype suprachoroidal retinal prosthesis. Clin Experiment Ophthalmol. , (2013).
- Lee, S. W., et al. Development of microelectrode arrays for artificial retinal implants using liquid crystal polymers. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 5859-5866 (2009).
- Sakaguchi, H., et al. Transretinal electrical stimulation with a suprachoroidal multichannel electrode in rabbit eyes. Jpn J Ophthalmol. 48, 256-261 (2004).
- Majji, A. B., et al. Long-term histological and electrophysiological results of an inactive epiretinal electrode array implantation in dogs. Invest Ophthalmol Vis Sci. 40, 2073-2081 (1999).
- Walter, P., et al. Successful long-term implantation of electrically inactive epiretinal microelectrode arrays in rabbits. Retina. 19, 546-552 (1999).
- Ray, A., Chan, L., Thomas, B., Weiland, J. D. Effects of prolonged stimulation at the electrode-retina interface. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 1, 1285-1287 (2006).
- Colodetti, L., et al. Pathology of damaging electrical stimulation in the retina. Experimental eye research. 85, 23-33 (2007).
- Nayagam, D. A. X., et al. Chronic Electrical Stimulation with a Suprachoroidal Retinal Prosthesis: A Preclinical Safety and Efficacy Study. PLoS One. 9, e97182 (2014).
- Nayagam, D. A. X., et al. Techniques for Processing Eyes Implanted With a Retinal Prosthesis for Localized Histopathological Analysis. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50411 (2013).
- Laube, T., et al. Development of surgical techniques for implantation of a wireless intraocular epiretinal retina implant in Gottingen minipigs. Graefe’s Archive For Clinical And Experimental Ophthalmology = Albrecht von Graefes Archiv fur klinische und experimentelle Ophthalmologie. 250, 51-59 (2012).
- Gerding, H., et al. Successful long-term evaluation of intraocular titanium tacks for the mechanical stabilization of posterior segment ocular implants. Mat.-wiss. u. Werkstofftech. 32, 903-912 (2001).
- Seo, J. -. M., et al. Silicon retinal tack for the epiretinal fixation of the polyimide electrode array. Current Applied Physics. 6, 649-653 (2006).
- Hadjinicolaou, A. E., et al. Electrical stimulation of retinal ganglion cells with diamond and the development of an all diamond retinal prosthesis. Biomaterials. 33, 5812-5820 (2012).
- Briggs, R. J., et al. Comparison of round window and cochleostomy approaches with a prototype hearing preservation electrode. Audiol Neurootol. 11, 42-48 (2006).
- Shepherd, R., et al. An improved cochlear implant electrode array for use in experimental studies. Hear Res. 277, 20-27 (2011).
- Tykocinski, M., et al. Comparison of electrode position in the human cochlea using various perimodiolar electrode arrays. Am J Otol. 21, 205-211 (2000).
- Hardie, N. A., MacDonald, G., Rubel, E. W. A new method for imaging and 3D reconstruction of mammalian cochlea by fluorescent confocal microscopy. Brain Res. 1000, 200-210 (2004).
