स्थानीयकृत Histopathological विश्लेषण के लिए एक रेटिना प्रोस्थेसिस के साथ प्रत्यारोपित प्रसंस्करण आंखें के लिए तकनीक: भाग रेटिना हमलों के साथ 2 Epiretinal समाविष्ट
Summary
Here we describe histological techniques for visualising ocular tissue directly adjacent to a metal epiretinal tack and retinal prosthesis.
Abstract
Retinal prostheses for the treatment of certain forms of blindness are gaining traction in clinical trials around the world with commercial devices currently entering the market. In order to evaluate the safety of these devices, in preclinical studies, reliable techniques are needed. However, the hard metal components utilised in some retinal implants are not compatible with traditional histological processes, particularly in consideration for the delicate nature of the surrounding tissue. Here we describe techniques for assessing the health of the eye directly adjacent to a retinal implant secured epiretinally with a metal tack.
Retinal prostheses feature electrode arrays in contact with eye tissue. The most commonly used location for implantation is the epiretinal location (posterior chamber of the eye), where the implant is secured to the retina with a metal tack that penetrates all the layers of the eye. Previous methods have not been able to assess the proximal ocular tissue with the tack in situ, due to the inability of traditional histological techniques to cut metal objects. Consequently, it has been difficult to assess localized damage, if present, caused by tack insertion.
Therefore, we developed a technique for visualizing the tissue around a retinal tack and implant. We have modified an established technique, used for processing and visualizing hard bony tissue around a cochlear implant, for the soft delicate tissues of the eye. We orientated and embedded the fixed eye tissue, including the implant and retinal tack, in epoxy resin, to stabilise and protect the structure of the sample. Embedded samples were then ground, polished, stained, and imaged under various magnifications at incremental depths through the sample. This technique allowed the reliable assessment of eye tissue integrity and cytoarchitecture adjacent to the metal tack.
Introduction
रेटिनाइटिस पिगमेंटोसा (आरपी) तंत्रिका गतिविधि में, photons के रूप में, प्रकाश transducing के लिए जिम्मेदार रेटिना की सबसे बाहरी परत में कोशिकाओं रहे हैं जो फोटोरिसेप्टर, की व्यापक हानि का कारण बनता है कि एक वंशानुगत बीमारी है। महत्वपूर्ण बात है, आरपी के साथ रोगियों को आम तौर पर अभी भी कार्य कर रहे हैं जो उनके रेटिना के अन्य परतों में अवशिष्ट न्यूरॉन्स है। रेटिना कृत्रिम अंग उनके दृश्य मार्ग 1,2 सक्रिय करने के लिए बिजली की उत्तेजना के साथ इन जीवित न्यूरॉन्स को लक्षित करके इन रोगियों को कुछ सीमित दृष्टि बहाल करने में सक्षम हैं। क्लिनिकल परीक्षण से परपेचुअल परिणामों जल्दी परिणाम आशाजनक से पता चला है और हाल ही में कुछ उपकरणों के वाणिज्यिक उपयोग के लिए मंजूरी दी गई है। Subretinally 5,6 और suprachoroidally 7,8 epiretinally 3,4,: वर्तमान में, तीन मुख्य संरचनात्मक नैदानिक रेटिना कृत्रिम अंग तैनात किया गया है, जिसमें स्थानों रहे हैं। विभिन्न उपकरणों के विभिन्न सामग्रियों के उपयोग और उनके फार्म अनुकूलित किया गया हैवे प्रत्यारोपित कर रहे हैं, जिसमें स्थान पर। हालांकि, वे सभी बिजली के दालों के साथ रेटिना के अवशिष्ट न्यूरॉन्स सक्रिय द्वारा दृश्य विचारों पैदा करते हैं।
किसी भी चिकित्सा कृत्रिम अंग होने के कारण प्रारंभिक नियुक्ति के यांत्रिक प्रभाव या बाद में चल रहे बलों के लिए आसपास के ऊतकों को नुकसान करने के लिए क्षमता है। ऐसे रेटिना कृत्रिम अंग के रूप में प्रत्यारोपण stimulators, के मामले में, बिजली के मानकों सुरक्षित सीमाओं के भीतर होना चाहिए कि अतिरिक्त विचार नहीं है। मरीज की सुरक्षा सर्वोपरि है, इसलिए उपकरणों कड़ाई से एक नैदानिक 9-15 स्थापित करने के लिए आगे बढ़ रहा है इससे पहले पूर्व नैदानिक अध्ययन में परीक्षण किया जाना चाहिए। हमारे साथी लेख में, हम suprachoroidal अंतरिक्ष 16 में तैनात एक प्रत्यारोपण आसपास के आंख के स्थानीयकृत ऊतकविकृतिविज्ञानी का आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णन किया। वर्तमान पांडुलिपि में, हम (फ़े एक preclinical में epiretinally रेटिना को हमला बोला एक इलेक्ट्रोड सरणी, आसपास के नेत्र ऊतक दृश्यमान करने के लिए एक तकनीक का वर्णनलाइन) मॉडल (चित्रा 1)।
epiretinal स्थान एक दृश्य कृत्रिम अंग लगाने के लिए सबसे अधिक उपयोग किया स्थिति है। यहां स्थित इलेक्ट्रोड सरणियों आमतौर पर आंख 17-20 के सभी परतों कि प्रवेश एक धातु कील के साथ रेटिना से चिपका रहे हैं। पहले वर्तमान पांडुलिपि में वर्णित तकनीकों के लिए, यह सही रेटिना और तुरंत एक कील आसपास के अन्य ऊतकों का आकलन करना मुश्किल था। तटस्थ बफर formalin का उपयोग कर मानक आंख निर्धारण के कारण हमले की नियत बिन्दु के खिलाफ रेटिना और श्वेतपटल का अंतर आंदोलन करने के लिए artifactual रेटिना क्षति हुई। इसलिए कील और epiretinal सरणी की वजह से किसी भी वास्तविक क्षति सही रूप में मनाया नहीं जा सका। धातु की वस्तुओं को आसानी से पारंपरिक ऊतकीय तंत्र के साथ कटौती नहीं की जा सकती रूप में इसके अलावा, नेत्र ऊतक सेक्शनिंग बगल में रेटिना कील के साथ नहीं किया जा सकता है; ऊतकीय प्रसंस्करण भी था पहले हमले को हटानेयह भी artifactual रेटिना क्षति के लिए नेतृत्व के रूप में अवांछनीय।
वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य दुगना था: कील और epiretinal प्रत्यारोपण सरणी की वजह से किसी भी नुकसान मज़बूती से मूल्यांकन किया जा सकता है, ताकि 1) रेटिना टुकड़ी मूर्ति को कम करने के लिए; और 2) इसे हटाने के बिना हमले से सटे रेटिना वास्तुकला कल्पना करने के लिए। Artifactual रेटिना delamination को कम कर देता है, जो (साथी अनुच्छेद 16 में वर्णित) उद्देश्य एक को प्राप्त करने के लिए, एक नया निर्धारण तकनीक का उपयोग किया गया था। उद्देश्य 2 को प्राप्त करने के क्रम में, हम पीस, और मूल रूप से कर्णावत प्रत्यारोपण इलेक्ट्रोड 21-23 की सीटू अवलोकन में लिए विकसित तकनीक, पॉलिश, एक एम्बेड संशोधित। artifactual रेटिना क्षति को न्यूनतम करने और इसलिए कील और epiretinal सरणी की वजह से किसी भी संभावित नुकसान का सटीक आकलन के लिए अनुमति देता है, जबकि इस पांडुलिपि में वर्णित विधि बगल में एक कील के लिए आसपास के रेटिना के दृश्य और आसन्न अनुमति देते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
स्टैंडर्ड ऊतकीय तकनीक की वजह से धातु, कांच या यहां तक कि हीरा ब्लेड के साथ इन वस्तुओं को काटने में सीमाओं के बगल में कठिन धातु प्रत्यारोपण संसाधित करने में असमर्थ रहे हैं। हमारे साथी पत्र 16 में, हम एक संशोधित पूरे आंख निर्धारण तकनीक का उपयोग artifactual रेटिना delamination कम हो सकता है कि पता चला है। वर्तमान पांडुलिपि में, एक पीस की स्थापना की और बगल में 21-23 रेटिना कृत्रिम अंग के लिए संशोधित किया गया था कर्णावत प्रत्यारोपण दृश्यमान करने के लिए तकनीक चमकाने। रेटिना के लिए एक इलेक्ट्रोड सरणी सुरक्षित करने के लिए उपयोग किया जाने वाला टाइटेनियम कील, epiretinally, आसपास के नेत्र ऊतक के साथ epoxy में एम्बेडेड था। इस राल ब्लॉक तो धातु हमले करने के लिए तुरंत आसन्न ऊतक आकृति विज्ञान प्रकट करने के क्रम में उचित रूप से उन्मुख है और उत्तरोत्तर जमीन / पॉलिश किया गया था। विभिन्न गहराई में ब्लॉक की पॉलिश सतह की छवियों को एक शक्तिशाली विच्छेदन माइक्रोस्कोप के साथ ले जाया गया। Visualizing और evaluat: इस तकनीक के लिए उपयोगी हैepiretinal प्रत्यारोपण के निकट ऊतक प्रतिक्रिया आईएनजी; प्रत्यारोपण के आरोपण के साथ जुड़े शल्य आघात का आकलन करने के लिए; कठिन धातु घटकों के लिए जैविक प्रतिक्रिया निर्धारित करने के लिए; और प्रत्यारोपण और रेटिना की सतह के बीच की दूरी को मापने के लिए।
इस तकनीक को आंखों में एक रेटिना कील या अन्य कठिन (जैसे, धातु) वस्तुओं से सटे क्षेत्र के सीटू दृश्य में के लिए भविष्य की सुरक्षा के अध्ययन में उपयोगी हो जाएगा। इस epiretinally रेटिना को हमला बोला कृत्रिम अंग के पूर्व नैदानिक सुरक्षा का आकलन करने में प्रत्यक्ष आवेदन किया है। यह भी उप रेटिना स्थान में स्थित प्रत्यारोपण के साथ संपर्क में रेटिना क्षेत्रों में ऊतकों को नुकसान के मूल्यांकन के लिए उपयोगी हो सकता है।
तकनीक सही ढंग से प्रदर्शन किया गया है सत्यापित करने के लिए कई तरीके हैं। प्रत्येक स्तर पर, रेटिना आंख की बाहरी परत से जुड़ी रहना चाहिए। सकल artifactual रेटिना टुकड़ी है, तो इस इंडिक सकता हैनियतन के साथ एक समस्या खा लिया। नमूना एम्बेडेड है और ब्लॉक के पीस-चेहरे के साथ orthogonal के करीब होना चाहिए रेटिना ब्लॉक अंतिम राल में केंद्रित कर रहे हैं; इस तिरछा काटने कम कर देंगे। यह (जैसे एक रेटिना कील के रूप में) एक वस्तु को पार करने के लिए आवश्यक (ज्ञात कदम आकार का) वृद्धिशील पीस कदम की संख्या वस्तु के आयामों के साथ तदनुसार सहसंबंधी कि जांच करने के लिए उपयोगी है।
तकनीक कई मायनों में अनुकूलित किया जा सकता है। पीसने की प्रक्रिया के साथ जुड़े epoxy के ब्लॉक की सतह पर खरोंच उत्तरोत्तर बेहतर ग्रेड चमकाने के साथ कम किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन के लिए, हम 800, 1000, 1200, 2400, और 4000 ग्रेड सिलिकॉन कार्बाइड कागज का इस्तेमाल किया। हीरे का पेस्ट भी सतह खत्म सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। एक महीन सतह खत्म एक उच्च गुणवत्ता छवि देता है, लेकिन अतिरिक्त चमकाने समय की कीमत पर। इस तकनीक के परिणाम में सुधार करने के लिए एक अन्य महत्वपूर्ण विचार OPTI की पसंद और गुणवत्ता हैसीएस और प्रकाश छवि को पकड़ने के लिए इस्तेमाल किया। अन्य बुनियादी ऊतकीय दाग – विशेष रूप से Nissl दाग, toluidine नीले रंग के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है, लेकिन आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। कुछ दाग राल के रूप में अच्छी तरह से ऊतक (जैसे, eosin), इसलिए एक उथले पोलिश पृष्ठभूमि रंग बिगाड़ना दूर करने के लिए धुंधला करने के बाद आवश्यक हो सकता है दाग होगा। विशेष दाग, फ्लोरोसेंट रंगों और immunohistochemical धुंधला करने का प्रयास नहीं किया गया था, लेकिन एक बहुत ही विशिष्ट परिणाम वांछित है, जब तक प्रत्येक पीस स्तर पर इन दाग प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक समय निषेधात्मक होने की संभावना है। हालांकि, यह embedding कदम (3.4 कदम) 24 से पहले एक पूरे के रूप में ऊतक दाग के लिए संभव हो सकता है।
इस तकनीक का मुख्य सीमा इसलिए, यह पीस और चमकाने के हर चरण में आवर्धन की एक किस्म में कई (संभवतः बेमानी) छवियों पर कब्जा करने के लिए समझदारी है, ब्याज के क्षेत्र दूर की गई जमीन है, एक बार इसे प्राप्त नहीं किया जा सकता है। यह हैयह भी महत्वपूर्ण प्रत्येक पीस गहराई समायोजन के लिए छोटे वेतन वृद्धि का उपयोग करने के लिए। इस तकनीक का एक और सीमा है कि ऊतक एक गिलास स्लाइड पर मुहिम शुरू की है और एक मानक (संचरण) प्रकाश माइक्रोस्कोप से देखा के साथ तुलना में ऑप्टिकल बढ़ाई और संकल्प की। प्रोटोटाइप और एक उपन्यास प्रत्यारोपण डिवाइस की सुरक्षा का आकलन करने के प्रयोजनों के लिए, सकल रोग मूल्यांकन प्राथमिक ब्याज की है। इस तकनीक में एक रेटिना कील के साथ जुड़े नैदानिक प्रासंगिक क्षति के अवलोकन के लिए एक कारगर तरीका प्रदान करता है। अभ्यास, पीस, पोलिश इकट्ठा और (एक बार एम्बेडेड) एक दिया नमूना तस्वीर करने के लिए आवश्यक कुल समय के साथ यह अनुभाग के लिए एक आयल ब्लॉक या फ्रोजन अनुभाग ले जाएगा समय के बराबर है।
रेटिना प्रत्यारोपण के दायरे से बाहर अनुप्रयोगों के लिए बढ़ाया जा करने के लिए वर्तमान तकनीकों के लिए क्षमता भी है। इस तकनीक प्रत्यारोपण निकासी feasib नहीं है जहां एक कठिन प्रत्यारोपण के निकट ऊतक का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूल हैLe या अंतरफलक नुकसान होगा। उदाहरण के लिए, इस तकनीक ऐसी दवा वितरण के लिए कुछ गहरी मस्तिष्क या परिधीय तंत्रिका इलेक्ट्रोड, cannulae के रूप में पारंपरिक ऊतकीय तकनीकों के साथ कटौती नहीं की जा सकती है कि धातु (उदाहरण के लिए, प्लेटिनम, Nitinol, आदि), से बना प्रत्यारोपण का मूल्यांकन करने के लिए विस्तारित किया जा सकता है, संवहनी स्टंट्स या आर्थोपेडिक कृत्रिम अंग।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nicole Vella (Macquarie University) for providing reagents; Alexia Saunder (Bionics Institute; BI), Michelle McPhedran (BI), Chris Williams (BI) for experimental support; the Royal Victorian Eye and Ear Hospital (RVEEH) Biological Research Centre staff for animal care; Sue Pierce (RVEEH) for veterinary advice; Anthony Burkitt (Bionic Vision Australia; BVA), Tamara Brawn (BVA) and the BVA staff for administrative support.
This research was supported by the Australian Research Council (ARC) through its Special Research Initiative (SRI) in Bionic Vision Science and Technology grant to Bionic Vision Australia (BVA). The Bionics Institute receives Operational Infrastructure Support from the Victorian Government and also acknowledges support from the Bertalli Family Trust and the J T Reid Charitable Trust. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
The Bionic Vision Australia Consortia authors for this manuscript are (a-z):
Penelope J. Allen, Owen Burns, Kate E. Fox, Kumaravelu Ganesan, David J. Garret, Hamish Meffin, Joel Villalobos, and Jonathan Yeoh.
Materials
| Name of the reagent / equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Acetone | Chem-Supply | AA008 | Propanone BHD Medical grade |
| Epo-Tek 301 Epoxy | Epoxy Technology | Part A 1675-54-3 Part B 9046-10-0 | |
| Ethanol 70-75% v/v | Merck PTY LTD | 4.10261 | Alcohol |
| Ethanol | Merck PTY LTD | 90143 | Alcohol |
| Toluidine blue O | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| TegraPol grinding/polishing machine | Struers | TegraPol-25 | |
| AccuStop specimen holder | Struers | Accustop | |
| Light microscope | Leica | MZ16 | |
| Objective lens | Leica | 2.0x Planapo Objective | |
| Digital Microscope Camera | Leica | DFC-420C | |
| Microscope Software | Leica | Application Suite v4.1.0 |
References
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