여기에서는 싱크로트론 X선 형광을 사용하여 샘플에서 금속의 양과 분포를 결정하는 방법에 대한 프로토콜을 제시합니다. 부착 세포에 초점을 맞추고 이 샘플을 준비하기 위한 화학적 고정 방법을 설명합니다. 그런 다음 싱크로트론 X-ray를 사용하여 샘플을 장착하고 이미지화하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
선 형광 이미징을 사용하면 크거나 작은 샘플 영역에서 여러 원소의 공간 분포 및 농도를 동시에 비파괴적으로 측정할 수 있습니다. 재료 과학, 지구 과학, 문화 유산 연구 및 화학 생물학을 포함한 많은 과학 분야에 적용되었습니다. 예를 들어, 화학 생물학의 경우 세포 내 금속 분포를 시각화하면 세포에서 자연적으로 발생하는 금속 이온뿐만 아니라 약물 및 나노 입자와 같은 외인성 유입 금속을 모두 연구할 수 있습니다. 거의 모든 생물학적 샘플의 완전히 수화된 특성으로 인해 극저온 온도에서 이미징 후 cryo-fixation은 현재 사용 가능한 이상적인 이미징 방식을 나타냅니다. 그러나 이러한 조합에 쉽게 접근할 수 없거나 실용적이지 않은 상황에서는 알데히드 기반 화학적 고정이 여전히 유용하고 때로는 불가피합니다. 이 기사에서는 X선 형광 이미징을 위한 화학적 고정에 의한 부착 포유류 세포의 준비에 대해 가능한 한 자세히 설명합니다.
서론
형광 이미징은 정체성과 샘플에 존재하는 원소의 양을 모두 허용 X 선은 공간적으로 해결한다. 입사 X 선은, 주목 무거운 요소의 결합 에너지 전자보다 크도록 선택된 에너지, 핵 (1)에 내측 쉘 전자의 결합 에너지를 극복. 이 전자 껍질에 '구멍'을 만듭니다. 높은 에너지의 전자가이 구멍으로 아래로 떨어질 때, 형광 X 선 파장이 그 궤도의 에너지 분리에 의존 방출된다. 오비탈의 에너지 간격은 주어진 요소의 특징이기 때문에, X 선 형광 발광 소자는 파장에 의존하는 특성을 갖는다. 그것은 본 요소의 식별을 허용 특성이 파장에서 발광된다. 형광 강도의 보정은 본 소자의 정량을 허용한다.
X 선 형광 microscopY (XFM)는 부분적으로 같은 봄-8 일본, 유럽 방사선 싱크로 시설 프랑스 (ESRF) 및 고급 광자 소스 (의 것과 매우 화려한 X 선 싱크로트론 소스의 개발, 점점 더 활용되고있다 미국 2 APS). 이 소스는 매우 높은 강도의 X 선 빔을 제공한다. 동시에, 이러한 존 플레이트 기술과 같은 X 선 광학 개선은 다소 비효율적 3이라도 서브 마이크론 이러한 스폿 빔의 포커싱을 허용했다. 매우 고강도 빔, 현재 이용 가능한 기술을 검출기로 측정 할 수있는....
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프로토콜
악기, 기판, 문화 미디어와 요리 1. 준비
- 실리콘 나이트 (시 3 N 4) 윈도우의 취급.
- 한편으로 캡슐의 타단을 회전시키면서 약간 창 자체 짜지하는 방식으로 윈도우를 함유 한 단부를 압착하여 캡슐을 연다.
- 역의 쌍을 확인, 실체 현미경 아래 뾰족한 핀셋 끝에 접착제, 틈새 나 굴곡이 없는지 확인합니다. 그렇지 않으면, 창은 핀셋으로 파손 또는 후속 단계에서 그들을 떨어져 비행 할 수있다.
- 부드럽게 윈도우의 가장자리가 나올 필요로하는 곳에 캡슐을 넓게 할 수 있도록하는 방향으로 압력을 개방 끝 부분에 캡슐을 압박하면서, 조심스럽게 핀셋 윈도우의 프레임을 잡고 캡슐에서 창을 제거합니다.
- 창 미리 세척 (선택 사항).
- 부드럽게를 담그고, 미리 세척 창을 원하는 경우70 % 에탄올에서 2 분 세척 100 % 에탄올에서 2 분 세척 한 다음 5 초 동안 증류수에.
- 부착 및 배양 접시에 창을 살균.
- 창문을 부착하기 위해, 배양 접시의 바닥에 평평한면을 위로해서 창을 설정, 깨끗한 유리 슬라이드에 테이프의 조각을 배치합니다. 테이프의 긴 측면 아래 기장 스트립을 약 잘라. 깨끗한 면도날 ....
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결과
생물학적 시료에 대한 정보를 제공하는 X 선 형광 영상의 능력은 이들 샘플들은 실험의 시간 규모에서 방사선 손상에 견고 이러한 방식으로 제조되는 달려 있으며, 아직 그들의 화학적 및 구조적 특징은 잘 아르 보존. 정착은 셀의 이러한 측면을 (도 1)를 보존 나타내는 - 전술 한 바와 같이 제조 및 묘화 된 시료의 결과를보고에서는, 본 소자의 변동이 있음을 볼 수있다.
반대로, 시료를 살펴봄 것이이 프로세스가 잘되지 않으며, 버퍼가 건조 중에 여전히 존재하는 경우, 본 분자로부터 광범위한 결정 형성은 세포에 구조적 손상을 생성하며 (X 선 형광 스펙트럼의 수집을 방해 그림 2).
이러한 이미지는 픽셀 별 맞춤으로써 생성된다 이미지의 각 지점에서 X 선 형광 스펙트럼. 이는 각 픽셀에서 수집 된 각 스펙트럼은, 개별적으로 분석 한 것을 의미한다. 피팅 된 데.......
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토론
X 선 형광 이미징은 지구과학, 재료 과학, 화학 생물학 26-34 등 많은 분야에서 유용하다. 싱크로트론 X- 레이의 발전, 그리고 그들의 초점은 매우 강도 높은 빔을 생산. 집중 X 선은 현재 이용 가능한 실리콘 드리프트 검출기 기술로 측정 할 수있다 신호를 생성하는 현재 존재하는 세포에서 내인성 금속을 자극하기에 충분한 광선. 그리고 셀 내에서 금속의 화학 생물학을 연구하는 것은이 분야에서 최근 많은 발전을 이용한다 특히 하나의 애플리케이션이다.
그들이 수화 때문에 그러나 X 선 형광 현미경을 사용하여 생체 재료의 연구는 또한, 다른 재료에 대해 특별한 과제를 제시한다. 방사선 손상을 방지하기 위해, 이상적으로 시료 측정시 유리체 얼음 동결 될 것이다. 그러나, 화학 고정 및 공기 건조는 초보자에게 훨씬 더 접근하고, 만약 적절한 금속 일 수있다관심 불활성으로 고칠 거대 분자에 결합하고, 샘플을 이미지화 된 해상도는 건조시 발생할 수있는 초 미세 구조.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 Stefan Vogt가 이 논문에 나타난 대표 데이터를 피팅하는 데 도움을 주고 유용한 논의를 제공한 것에 대해 감사를 표합니다. 저자는 또한 Q. J.에 대한 크리스 제이콥슨의 지지에 감사를 표한다.
아르곤 국립 연구소의 고급 광자 소스, 빔라인 2-ID-E 및 8-BM-B의 사용은 계약 번호에 따라 미국 에너지부, 과학실, 기초 에너지 과학국의 지원을 받았습니다. DE-AC02-06CH11357입니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 질화규소 Windows | Silson Ltd/JBJ Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, 영국 | SiRN-5.0-200-2.0-200. 크기별로 정렬합니다. 멤브레인 크기: 1.5 mm x 1.5 mm. 두께: 200 nm입니다. 프레임 크기: 5 mm x 5mm입니다. 프레임 두께: 200 &m. | 대체 출처: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA. |
| 리버스 핀셋 | Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, 전화: 215-412-8400, 수신자 부담 전화: 800-523-5874, 팩스: 215-412-8450 | 78520-5X | EMS 5X, NC – 울트라 파인 핀셋 |
| 고무 그리드 매트 | 전자 현미경 과학, PO Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, 전화 : 215-412-8400, 수신자 부담 전화 : 800-523-5874, 팩스 : 215-412-8450 | 71170 | 원형 그리드 매트 |
| 아세트산 | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, 전화 : 800-325-3010, 팩스 : 800-325-5052 | 338826 | 미량 금속 등급 농축 아세트산 |
| PIPES 버퍼 | Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, 전화: 800-325-3010, 팩스: 800-325-5052 | P6757 | 고체 파이프 버퍼 |
| 포름알데히드 원액 | 전자 현미경 과학, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, 전화: 215-412-8400, 수신자 부담 전화: 800-523-5874, 팩스: 215-412-8450 | RT 17113 | 10 x 10ml 앰플 20% 수성 파라포름알데히드 |
참고문헌
- Thompson, A. C. Center for X-ray Optics and Advanced Light Source. , 1-53 (2009).
- Helliwell, J. R. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 5, 614-617 (1988).
- Lai, B., et al. X-ray Phase Zone Plate Fabricated by Lithographic Techniques. Appl. Phys. Lett. 6....
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