Axotomia do nervo facial em ratos: um modelo para estudo de resposta motoneuron para Injury
Summary
We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.
Abstract
O objetivo deste protocolo cirúrgico é expor o nervo facial, que inerva a musculatura facial, em sua saída do forame estilomastóideo e cortar ou esmagá-lo para induzir lesões de nervos periféricos. As vantagens desta cirurgia são sua simplicidade, alta reprodutibilidade, bem como a falta de efeito sobre as funções vitais ou mobilidade da conseqüente paralisia facial, resultando assim em um resultado cirúrgico relativamente leves em comparação com outros modelos de lesão do nervo. Uma importante vantagem da utilização de um modelo de lesão de nervo craniano é que os motoneurónios residir numa população relativamente homogénea no núcleo motor facial na ponte, simplificar o estudo dos corpos celulares de motoneurónios. Devido à natureza simétrica da inervação do nervo facial e a ausência de interferência entre os núcleos motores faciais, a operação pode ser realizada de forma uni com o lado unaxotomized servindo como um controlo interno emparelhado. Uma variedade de análises pode ser realizada no pós-operatório para avaliaré a resposta fisiológica, cujos detalhes estão fora do escopo deste artigo. Por exemplo, a recuperação da função muscular pode servir como um marcador para Reinervação comportamental, ou os neurónios motores podem ser quantificados para medir a sobrevivência das células. Além disso, os neurónios motores podem ser capturadas com precisão usando microdissecação laser para análise molecular. Porque a axotomia do nervo facial é minimamente invasiva e bem tolerada, pode ser utilizada numa ampla variedade de ratinhos geneticamente modificados. Além disso, este modelo de cirurgia pode ser utilizado para analisar a eficácia dos tratamentos de lesão do nervo periférico. A lesão do nervo facial proporciona um meio para investigar não apenas neurónios motores, mas também as respostas do microambiente central e periférica da glia, o sistema imunológico, e musculatura alvo. O modelo de lesão do nervo facial é um modelo de lesão de nervo periférico amplamente aceite que serve como uma ferramenta poderosa para o estudo da lesão e da regeneração do nervo.
Introduction
Existem muitos modelos de lesão de nervos periféricos, mas uma que se destaca para o estudo da motoneurons é o modelo de axotomia do nervo facial. O nervo facial, também conhecido como nervo craniano VII, se origina na ponte e inerva os músculos da expressão facial 1,2. Neste protocolo cirúrgico, o nervo facial é exposto na sua saída do forame estilomastóideo e cortados ou triturados. A gravidade da lesão do nervo pode ser classificado de acordo com as Sunderland 3 classificações, o que diferencia o prejuízo com base na intactness do axônios, endoneuro, perineuro e epineuro, que são camadas de tecido conjuntivo que sequencialmente envolver em torno dos feixes de axônios. Na lesão por esmagamento (axonotmesis), os axônios são cortados, mas o perineuro e epineuro são preservados. Recuperação funcional completa de esmagamento do nervo facial ocorre em cerca de 11 dias, porque a bainha do nervo intacta serve como um canal dentro do qual os axônios crescerem 4,5. NoPor outro lado, na lesão de corte (neurotmesis), os axônios e todos os 3 camadas de tecido conjuntivo são cortados, e todo o nervo distal deve regredir para restaurar a musculatura inervação. Reconexão cirúrgica do epineuro é freqüentemente realizado em pacientes humanos com lesões na secção do nervo, no entanto os resultados de recuperação são raramente ideal. Mais estudos são necessários para entender por que o nervo não regredir ao seu alvo e quais as terapias podem ser empregadas para melhorar e acelerar o processo regenerativo.
Há muitas vantagens em estudar a lesão do nervo utilizando o modelo de axotomia do nervo facial. Primeiro, o procedimento axotomia do nervo facial é rápido, fácil e altamente reprodutível; e a paralisia resultante dos músculos faciais não tem impacto sobre as funções vitais e é bem tolerado pelos animais. Porque este é um modelo de lesão de nervos cranianos, estudando os corpos celulares motoneuron é simplificada porque os neurónios motores residem em uma população relativamente homogênea em the núcleo motor facial na ponte. A população não diferem com base no padrão subnuclear dentro do núcleo motor facial, pois há sete subnúcleos cada um específico para que inervam um grupo específico de músculos, de modo diferenças subnucleares em resposta a axotomia pode influir no resultado 2,6,7.
Uma grande vantagem do modelo de lesão do nervo facial é que o lado unaxotomized pode servir como um controlo interno emparelhado porque a inervação do nervo é altamente simétrico e não há interferência entre os núcleos motores faciais 8. Outra vantagem da utilização deste método cirúrgico é a ausência de trauma directo para o SNC ou o rompimento da barreira hematoencefálica 9. Complicações como sangramento excessivo e infecção são raras com este procedimento.
Uma variedade de análises podem ser realizadas para avaliar a resposta fisiológica à lesão do nervo. A recuperação do reflexo de pestanejo ocular e actividade suiça pode ser usado como um comportamentalmedida de funcional 10,11 recuperação. A gravação de vídeo de atividade vibrissae é atualmente o método mais poderoso para a detecção de recuperação de inervação do nervo facial 12,13. Após a eutanásia, análise histológica do tronco cerebral pode ser realizada sobre os corpos de células de motoneurónios no núcleo motor facial. O núcleo motor facial é subdividida em sete subnúcleos, cada uma específica para certos músculos faciais, permitindo a análise diferencial de respostas a lesão 2,6. Motoneurónios faciais podem ser contadas para quantificar a sobrevivência de células, ou imuno-histoquímica pode ser usada para identificar biomarcadores e populações de células específicas 14. O núcleo motor facial pode ser microdissecadas de captura com precisão usando a laser para a análise molecular da resposta celular a lesão do nervo 15,16. Impactos da axotomia do nervo facial podem ser analisados no córtex motor 17,18. Além disso, o nervo pode ser dissecado para estudar a degeneração Walleriana 19 ouregeneração axonal 20, e os músculos pode ser removido para estudar junções neuromusculares 21. A axotomia do nervo facial também pode ser usado para estudar as células gliais centrais e periféricos anexos 22, 21 musculatura alvo, e a resposta do sistema imunitário 23. Embora muito tenha sido feito em estudar o modelo de axotomia do nervo facial 24, um estudo mais aprofundado de lesão do nervo periférico é necessária porque dano do nervo é um problema significativo para os pacientes e os tratamentos atuais não conseguem produzir os melhores resultados. Este modelo é uma ferramenta poderosa para a análise da resposta fisiológica à lesão do nervo e analisar a eficácia das terapias de regeneração do nervo.
Protocol
Representative Results
Discussion
The critical step for this protocol is positioning the mouse properly before surgery is begun. If the mouse is not lying flat on its side, the ear is not taped at the correct angle, or the incision is made in an incorrect location, then finding the facial nerve becomes much more difficult. When this technique is mastered, surgeries will take only minutes per mouse.
Either sutures, glue, or wound clips can be used to close the wound. Wound clips are preferred because of the small size of incis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is funded by NIH RO1 NS 40433 (K.J.J.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stereo Microscope | Leica | M60 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | 15-952 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5cm/5mm cutting edge | Fine Science Tools | 15003-08 | Sterilize before use |
| Dumont #5/45 Forceps – Standard tips/Angled 45°/Dumoxel/11cm | Fine Science Tools | 11251-35 | Sterilize before use |
| Michel Suture Clips – 7.5mm x 1.75 mm | Fine Science Tools | 12040-01 | Described as "wound clip" in protocol, sterilize before use |
| Hagenbarth Cross Action Wound Clip Applier 5" | George Tiemann & Co | 160-910 | Used to apply wound clip, sterilize before use |
| Michel Suture Clip Applicator & Remover – For 7.5 mm Clips | Fine Science Tools | 12029-12 | Used to remove wound clip |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Betadine, 16 oz, with dispenser | Fisher Scientific | 19-027132 | |
| 70% Ethanol | |||
| Glass Bead Sterilizer |
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