Лицевого нерва аксотомии у мышей: модель для изучения двигательных нейронов ответ на повреждение
Summary
We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.
Abstract
Цель этого хирургического протокола является выявление лицевого нерва, который иннервирует лицевой мускулатуры, при выходе ее из stylomastoid отверстия и вырезан или раздавить его, чтобы вызвать повреждение периферического нерва. Преимущества этой операции являются его простота, высокая воспроизводимость, а также отсутствие влияния на жизненно важных функций или подвижности из последующего паралич лицевого нерва, что приводит к относительно мягкой хирургического результата по сравнению с другими моделей повреждения нерва. Одним из основных преимуществ использования черепной модель повреждения нерва является то, что мотонейроны находятся в относительно однородной популяции в лицевой двигательной ядра в моста, что упрощает изучение клеточных тел мотонейронов. Из-за симметричной природы лицевого нерва иннервации и отсутствие перекрестных помех между лицевыми ядер двигательных операция может быть выполнена в одностороннем порядке unaxotomized сторона, выступающей в качестве парного внутреннего контроля. Разнообразие анализов могут быть выполнены в послеоперационном периоде, чтобы ословš физиологическая реакция, детали которого выходит за рамки данной статьи. Например, восстановление мышечной функции может служить маркером для поведенческого реиннервации, или мотонейроны можно количественно измерить выживаемость клеток. Кроме того, мотонейроны могут быть точно получены с помощью лазерного микродиссекции для молекулярного анализа. Поскольку лицевой нерв аксотомии является минимально инвазивной и хорошо переносимым, оно может быть использовано на разнообразных генетически модифицированных мышей. Кроме того, эта операция модель может быть использована для анализа эффективности периферических лечения повреждений нервов. Травмы лицевого нерва предоставляет средства для исследования не только двигательные нейроны, но и ответы центральной и периферической глии микросреды, иммунной системы, и целевой мускулатуры. Лица модели повреждения нерва широко принятой моделью периферических нервов травмы, которая служит в качестве мощного инструмента для изучения повреждение нерва и регенерации.
Introduction
Существует множество периферийных модели повреждения нерва, но тот, который выделяется для изучения двигательных нейронов является лицевая модель нерв аксотомии. Лицевого нерва, также известный как черепно-мозговых нервов VII, берет свое начало в Понс и иннервирует мышцы мимики 1,2. В этом хирургического протокола, лицевой нерв подвергается при выходе ее из stylomastoid отверстия и либо сократить или дробленый. Тяжесть травмы нерва могут быть классифицированы в соответствии с Сандерленд 3 классификаций, которые отличает эту травму, основанную на сохранности аксонов, Эндоневрий, Периневрий и эпиневрии, которые соединительной слои ткани, последовательно обернуть вокруг аксонов пучков. В размозжение (Axonotmesis), аксоны разорваны, но Периневрий и Эпиневрий сохраняются. Полное восстановление функций от лицевого нерва давка встречается примерно в 11 дней, потому что нетронутыми оболочки нервов служит каналом, в рамках которой аксоны вырастить 4,5. НаС другой стороны, в разрезе травмы (neurotmesis), аксоны и все три слоя соединительной ткани разорваны, и весь дистальный нерв должен вырастить, чтобы восстановить мускулатуру иннервацию. Хирургическое повторного подключения эпиневрии часто выполняется у больных людей с пересечения нерва травм, однако результаты восстановления редко оптимальным. Требуется дальнейшее изучение, чтобы понять, почему нерв не удается вырастить его целей, и что методы лечения могут быть использованы для улучшения и ускорения процесс регенерации.
Есть много преимуществ для изучения повреждение нерва с помощью лицевой модель нерв аксотомии. Во-первых, лица процедура нерва аксотомии быстро, легко и надежно воспроизводимое; и результирующая паралича лицевых мышц не влияет на жизненно важные функции и хорошо переносится животным. Потому что это черепной модель повреждение нерва, изучая мотонейроного клеточных тел упрощается, потому что мотонейроны находятся в относительно однородной популяции в гок двигателю лица ядро в мосте. Население действительно отличается на основе субъядерной рисунка в лице ядра двигателя, так как есть семь subnuclei каждый конкретный чтобы иннервирующих определенную группу мышц, так субъядерных различия в ответ на аксотомии может повлиять на результаты 2,6,7.
Основное преимущество лицевого модели повреждения нерва является то, что unaxotomized сторона может служить в паре внутреннего контроля, потому что нерв иннервации очень симметричны и нет перекрестных помех между лицевыми моторных ядер 8. Еще одним преимуществом использования этого хирургического метода является отсутствие прямого травмы ЦНС или нарушению гематоэнцефалического барьера 9. Такие осложнения, как кровотечения и инфекции являются редкими с этой процедурой.
Разнообразие анализов могут быть выполнены, чтобы оценить физиологическую реакцию на повреждение нерва. Восстановление моргание глазом рефлекса и усов активности может быть использован в качестве поведенческогомера функционального восстановления 10,11. Видеозапись вибриссы деятельности в настоящее время наиболее эффективным методом для обнаружения восстановление лицевого нерва иннервации 12,13. После эвтаназии, гистологический анализ ствола мозга может быть выполнена на мотонейронов клеточных тел в ядре лицевого двигателя. Лица ядро двигателя подразделяется на семь subnuclei, каждый специфическими для определенных мышц лица, что позволяет для дифференциальной Исследование реакций на травму 2,6. Мотонейроны лица могут быть подсчитаны количественно выживаемость клеток, или иммуногистохимии могут быть использованы для идентификации биомаркеров и конкретные клеточные популяции 14. Ядро лицевого двигателя может быть точно микродиссекции с помощью лазерного захвата для молекулярного анализа клеточного ответа на повреждение нерва 15,16. Воздействие лицевого нерва аксотомии могут быть проанализированы в моторной коре 17,18. Кроме того, нерв может быть расчленена изучать валлеровский дегенерации 19 илиАксон регенерации 20, и мышцы могут быть удалены, чтобы изучить нервно-мышечных синапсах 21. Лицевого нерва аксотомии также может быть использован для изучения прилагаемой центральные и периферические клетки 22 глиальные, целевой мускулатуру 21, и иммунная система реагирования 23. Хотя многое уже сделано в изучении лицевого нерва аксотомии модель 24, дальнейшее изучение повреждения периферического нерва требуется, потому что повреждение нерва является существенной проблемой для пациентов и текущие методы лечения не для получения оптимальных результатов. Эта модель является мощным инструментом для изучения физиологической реакции на повреждение нерва и анализа эффективности регенерации нерва терапии.
Protocol
Representative Results
Discussion
The critical step for this protocol is positioning the mouse properly before surgery is begun. If the mouse is not lying flat on its side, the ear is not taped at the correct angle, or the incision is made in an incorrect location, then finding the facial nerve becomes much more difficult. When this technique is mastered, surgeries will take only minutes per mouse.
Either sutures, glue, or wound clips can be used to close the wound. Wound clips are preferred because of the small size of incis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is funded by NIH RO1 NS 40433 (K.J.J.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stereo Microscope | Leica | M60 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | 15-952 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5cm/5mm cutting edge | Fine Science Tools | 15003-08 | Sterilize before use |
| Dumont #5/45 Forceps – Standard tips/Angled 45°/Dumoxel/11cm | Fine Science Tools | 11251-35 | Sterilize before use |
| Michel Suture Clips – 7.5mm x 1.75 mm | Fine Science Tools | 12040-01 | Described as "wound clip" in protocol, sterilize before use |
| Hagenbarth Cross Action Wound Clip Applier 5" | George Tiemann & Co | 160-910 | Used to apply wound clip, sterilize before use |
| Michel Suture Clip Applicator & Remover – For 7.5 mm Clips | Fine Science Tools | 12029-12 | Used to remove wound clip |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Betadine, 16 oz, with dispenser | Fisher Scientific | 19-027132 | |
| 70% Ethanol | |||
| Glass Bead Sterilizer |
References
- Kaufman, M., Bard, J. . The Anatomical Basis of Mouse Development. , (1999).
- Ashwell, K. The adult mouse facial nerve nucleus: morphology and musculotopic organization. Journal of Anatomy. 135, 531-538 (1982).
- Sunderland, S. A classification of peripheral nerve injuries producing loss of function. Brain : A Journal Of Neurology. 74, 491-516 (1951).
- Beahrs, T., Tanzer, L., Sanders, V. M., Jones, K. J. Functional recovery and facial motoneuron survival are influenced by immunodeficiency in crush-axotomized mice. Experimental Neurology. 221, 225-230 (2010).
- Mesnard, N. A., Haulcomb, M. M., Tanzer, L., Sanders, V., Jones, K. J. Delayed functional recovery in presymptomatic mSOD1G93A mice following facial nerve crush axotomy. Journal of Neurodegeneration & Regeneration. 4, 21-25 (2013).
- Komiyama, M., Shibata, H., Suzuki, T. Somatotopic representation of facial muscles within the facial nucleus of the mouse. A study using the retrograde horseradish peroxidase and cell degeneration techniques. Brain Behav Evol. 24, 144-151 (1984).
- Canh, M. Y., Serpe, C. J., Sanders, V., Jones, K. J. CD4(+) T cell-mediated facial motoneuron survival after injury: Distribution pattern of cell death and rescue throughout the extent of the facial motor nucleus. Journal of Neuroimmunology. 181, 93-99 (2006).
- Isokawa-Akesson, M., Komisaruk, B. Difference in projections to the lateral and medial facial nucleus: anatomically separate pathways for rhythmical vibrissa movement in rats. Exp Brain Res. 65, 385-398 (1987).
- Streit, W., Kreutzberg, G. Response of endogenous glial cells to motor neuron degeneration induced by toxic ricin. The Journal of Comparative Neurology. 268, 248-263 (1988).
- Serpe, C. J., Tetzlaff, J. E., Coers, S., Sanders, V., Jones, K. J. Functional recovery after facial nerve crush is delayed in severe combined immunodeficient mice. Brain, Behavior, And Immunity. 16, 808-812 (2002).
- Lal, D., et al. Electrical stimulation facilitates rat facial nerve recovery from a crush injury. Otolaryngology–Head And Neck Surgery. Official Journal Of American Academy Of Otolaryngology-Head And Neck Surgery. 139, 68-73 (2008).
- Tomov, T., et al. An Example of Neural Plasticity Evoked by Putative Behavioral Demand and Early Use of Vibrissal Hairs after Facial Nerve Transection. Experimental Neurology. 178, 207-218 (2002).
- Skouras, E., Angelov, D. N. Experimental studies on post-transectional facial nerve regrowth and functional recovery of paralyzed muscles of the face in rats and mice. Anatomy (International Journal of Experimental and Clinical Anatomy). 4, 1-27 (2010).
- Xin, J., et al. IL-10 within the CNS is necessary for CD4+ T cells to mediate neuroprotection). Brain, Behavior, And Immunity. 25, 820-829 (2011).
- Mesnard, N. A., Sanders, V. M., Jones, K. J. Differential gene expression in the axotomized facial motor nucleus of presymptomatic SOD1 mice. The Journal of Comparative Neurology. 519, 3488-3506 (2011).
- Mesnard, N. A., Alexander, T. D., Sanders, V. M., Jones, K. J. Use of laser microdissection in the investigation of facial motoneuron and neuropil molecular phenotypes after peripheral axotomy. Experimental Neurology. 225, 94-103 (2010).
- Franchi, G. Changes in motor representation related to facial nerve damage and regeneration in adult rats. Experimental Brain Research. 135, 53-65 (2000).
- Munera, A., Cuestas, D. M., Troncoso, J. Peripheral facial nerve lesions induce changes in the firing properties of primary motor cortex layer 5 pyramidal cells. 신경과학. 223, 140-151 (2012).
- Liu, L., et al. Hereditary absence of complement C5 in adult mice influences Wallerian degeneration, but not retrograde responses, following injury to peripheral nerve. Journal of the Peripheral Nervous System. 4, 123-133 (1999).
- Ferri, C., Moore, F., Bisby, M. Effects of facial nerve injury on mouse motoneurons lacking the p75 low-affinity neurotrophin receptor. Journal of Neurobiology. 34, 1-9 (1997).
- Zhou, R. Y., Xu, J., Chi, F. L., Chen, L. H., Li, S. T. Differences in sensitivity to rocuronium among orbicularis oris muscles innervated by normal or damaged facial nerves and gastrocnemius muscle innervated by somatic nerve in rats: combined morphological and functional analyses. The Laryngoscope. 122, 1831-1837 (2012).
- Jinno, S., Yamada, J. Using comparative anatomy in the axotomy model to identify distinct roles for microglia and astrocytes in synaptic stripping. Neuron Glia Biology. 7, 55-66 (2011).
- Jones, K. J., Serpe, C. J., Byram, S. C., Deboy, C. A., Sanders, V. M. Role of the immune system in the maintenance of mouse facial motoneuron viability after nerve injury. Brain, Behavior, And Immunity. 19, 12-19 (2005).
- Moran, L. B., Graeber, M. B. The facial nerve axotomy model. Brain research. Brain research. 44, 154-178 (2004).
- Council, N. R. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , (2011).
- Serpe, C. J., Kohm, A. P., Huppenbauer, C. B., Sanders, V., Jones, K. J. Exacerbation of Facial Motoneuron Loss after facial nerve transection in severe combined immunodeficient (scid) mice. 신경과학. 19, (1999).
- Mesnard-Hoaglin, N. A., et al. SOD1(G93A) transgenic mouse CD4(+) T cells mediate neuroprotection after facial nerve axotomy when removed from a suppressive peripheral microenvironment. Brain, Behavior, And Immunity. 40, 55-60 (2014).
- Wang, H., et al. Establishment and assessment of the perinatal mouse facial nerve axotomy model via a subauricular incision approach. Experimental Biology And Medicine. 237, 1249-1255 (2012).
- Sharma, N., Moeller, C. W., Marzo, S. J., Jones, K. J., Foecking, E. M. Combinatorial treatments enhance recovery following facial nerve crush. The Laryngoscope. 120, 1523-1530 (2010).
- Lieberman, D. M., Jan, T. A., Ahmad, S. O., Most, S. P. Effects of corticosteroids on functional recovery and neuron survival after facial nerve injury in mice. Archives of Facial Plastic Surgery. 13, 117-124 (2011).
- Serpe, C. J., Coers, S., Sanders, V. M., Jones, K. J. CD4+ T, but not CD8+ or B, lymphocytes mediate facial motoneuron survival after facial nerve transection. Brain, Behavior, And Immunity. 17, 393-402 (2003).
- Haulcomb, M. M., et al. Axotomy-induced target disconnection promotes an additional death mechanism involved in motoneuron degeneration in ALS transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. , (2014).
- Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (60), (2012).
- Richner, M., Bjerrum, O. J., Nykjaer, A., Vaegter, C. B. The spared nerve injury (SNI) model of induced mechanical allodynia in mice. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (54), (2011).
