We describe methods for longitudinal monitoring of the efficacy of therapeutics for the treatment of colonic pathologies in mice using a rigid endoscope. This protocol can be readily used for the characterization of the therapeutic response of an individual tumor in live mice and also for monitoring potential disease relapse.
Animal models of inflammatory bowel disease (IBD) and colorectal cancer (CRC) have provided significant insight into the cell intrinsic and extrinsic mechanisms that contribute to the onset and progression of intestinal diseases. The identification of new molecules that promote these pathologies has led to a flurry of activity focused on the development of potential new therapies to inhibit their function. As a result, various pre-clinical mouse models with an intact immune system and stromal microenvironment are now heavily used. Here we describe three experimental protocols to test the efficacy of new therapeutics in pre-clinical models of (1) acute mucosal damage, (2) chronic colitis and/or colitis-associated colon cancer, and (3) sporadic colorectal cancer. We also outline procedures for serial endoscopic examination that can be used to document the therapeutic response of an individual tumor and to monitor the health of individual mice. These protocols provide complementary experimental platforms to test the effectiveness of therapeutic compounds shown to be well tolerated by mice.
Kolorektal cancer (CRC) er den 4. mest almindelige årsag til malignitet verdensplan 1. Trods de betydelige fremskridt i vores forståelse af familiær baggrund af denne sygdom, genetisk disposition vedrører kun ~ 20% af CRC tilfælde 2. Resten tilskrives mange ydre og miljømæssige faktorer, herunder kronisk inflammation. Hos mennesker er tydeligt i colitis ulcerosa (UC) patienter, som har en større risiko for at udvikle colitis-associeret tyktarmskræft (CAC) forbindelsen mellem kronisk inflammation og tyktarmskræft, afhængig af varigheden, omfanget og alvoren af den inflammatoriske sygdomme 3 -5. Derfor nye terapier er under udvikling til at styre immunrespons og den tilhørende produktion af vækstfremmende faktorer ved den inflammatoriske tumormikromiljøet 6-8 den. Der er et stigende behov for hensigtsmæssige prækliniske dyremodeller til at karakterisere den terapeutiske effekt afdisse lægemidler mod udvikling og progression af sygdommen.
Musemodeller har entydigt vist, at den inflammatoriske mikromiljø bidrager til CRC progression, selv i fravær af åbenlys betændelse 9,10. Disse modeller indbefatter anvendelsen af polysaccharidet dextransulfat-natrium (DSS), forudsat i drikkevandet af mus, til at modellere epithelial skade og akut og kronisk inflammatorisk tarmsygdom (IBD) 11,12. Selvom den mekanisme, ved hvilken DSS inducerer slimhindeskade og colitis ikke er helt forstået, nogle undersøgelser tyder på, at DSS inhiberer cellulære revers transkriptase og ribonuklease aktiviteter i celler eller fremmer dannelsen af nano-lipid komplekser, der fusionerer med colon membran fører til epitelbeskadigelse 13,14. Ændringer af standard DSS modellen har også givet en betydelig indsigt i de mekanismer, som colon epitelceller opretholde vævshomeostase og formellesen mucosale immunresponser 15.
Intraperitoneal administration af azoxymethan (AOM) alene eller i kombination med DSS, indeholder en model for at undersøge samspillet mellem somatiske mutationer i epitel slimhinde og den inflammatoriske og stromale mikromiljø 16,17. AOM er en metabolit af det kræftfremkaldende stof 1,2-dimethylhydrazin (DMH), som ikke er knyttet direkte i DNA-mutationer. I stedet AOM hydrolyseres til methylazoxymethanol (MAM) af cytochrom isoform CYP2E1 i leveren, hvor MAM er konjugeret med glucuronsyre og derefter transporteres til tarmen via galde sekreter 18. Det menes, at det bakterielle β-glucuronidase bidrager til nedbrydningen af MAM resulterer i DNA alkylering og akkumuleringen af mutationer i epitelceller 19. De fleste AOM-inducerede colon tumorer harbor missense mutationer i genet, der koder β-catenin, hvilket gør proteinet resistent over proteasomalaktivitet degradatipå, hvilket resulterer i afvigende aktivering af den kanoniske Wnt-signalvejen 20. Når aktiviteten af AOM er kombineret med slimhindeskader fremkaldt af DSS, den efterfølgende sårheling reaktion skaber et mikromiljø, der fremmer vækst og ekspansion af det mutageniserede epitel. I en variation af denne model kan gentagne administration af AOM alene over en periode på flere uger bruges til at modellere sporadisk kolorektal cancer, i fravær af DSS-induceret colitis 10,17. Disse to gratis modeller giver forsøgsopstillingen at studere CAC og sporadisk CRC henholdsvis, som begge er forbundet med en pro-inflammatorisk tumormikromiljøet 10.
Anvendelsen af serielle endoskopi i mus blev udviklet af Becker og kolleger 21 og muliggør langsgående overvågning af colitis og tumorprogression. Her giver vi tre prækliniske protokoller baseret på DSS-induceret mucosal skader og / eller AOM-medieret tumor induktion til reproducerbart at inducere specifikke colon patologier. Den første protokol beskriver inducere akut slimhindeskade som reaktion på DSS administration at fremkalde mange af de histopatologiske træk forbundet med IBD. Den anden protokol er baseret på tre på hinanden følgende cyklusser af DSS administration at efterligne opblussen af inflammation ofte hos IBD patienter, og kan udføres i forbindelse med AOM-inducerede mutationer. Den endelige protokol er baseret på AOM-inducerede sporadiske epiteliale mutationer. For hver af disse protokoller, vi udvider på de relevante standardprocedurer til at omfatte profylaktisk og terapeutisk intervention metoder, som vi har udviklet for at overvåge effektiviteten af nye lægemidler.
De tre protokoller, der er beskrevet skitsere metoder til pålidelig og reproducerbar induktion af colon sygdom patologi i mus. Når det kombineres med rutinemæssig endoskopisk kontrol og interventionsstrategier skitseret her, vil disse protokoller giver kraftig prækliniske indsigt i effekten af lægemidler. Vores laboratorier rutinemæssigt bruger alle disse protokoller til at overvåge succesen af nye lægemidler 10,23,24.
Der er en række overvejelser, når de vælger en præklinisk dyremodel til at teste nye lægemidler. Disse omfatter relevans af modellen til den menneskelige sygdom, og bidraget fra tumormikromiljøet til forslaget af det terapeutiske mål. Her giver vi tre protokoller for terapeutisk intervention i etablerede tarm sygdomsmodeller. Disse modeller er reproducerbare og levering af reagenser til at fremkalde sygdom er nem at administrere. Vigtigt er det, modellerne er meget relevantetil flere facetter og stadier af colitis debut, og tumor initiering og progression. Forskerne bør tage hensyn til den genetiske baggrund af musestammer anvendt ved konstruktionen eksperimenter, som modtagelighed for sygdom fremkaldt af DSS og / eller AOM kan variere betydeligt 25. Desuden kan forskellige mikrobielle samfund har forskellige metaboliske kapacitet i forbindelse med AOM, som metaboliseres af bakterierne. Vi advarer mod at bruge forskellige kohorter af mus, som blev født i forskellige dyr faciliteter (herunder kommercielle leverandører) i et enkelt forsøg. Tilsvarende kan forskellige mikroflora i mus anvendes fra forskellige faciliteter fremkalde forskellige værtsresponser til DSS-induceret epitelbarriere skade 11. Endvidere bør passende analyse af væv (for eksempel RNA oprensning) også tages i betragtning, da evnen til DSS til at inhibere revers transkriptase vil påvirke efterfølgende molekylær analyse 26,27.
<p class = "jove_content"> Mus endoskopi er en forkant teknik til gentagne gange at overvåge sygdommens debut og progression i en individuel mus. Evnen til at optage videoer og udtrække stillbilleder tillader nem overvågning af flere sygdomstilstande parametre og tumorer. Ud over at forbedre dyrevelfærden, endoskopisk overvågning reducerer også behovet for flere grupper af eksperimentelle mus, der traditionelt er blevet aflivet på forskellige tidspunkter at spore resultat sygdom. Det MEICS pointsystem er ikke en erstatning for histopatologisk analyse, men giver et alternativt middel til at overvåge dyrenes sundhed og slimhindeskader med levende mus. Mus endoskopi er et specialiseret laboratorium teknik, og alle procedurer skal udføres af uddannet personale til at sikre passende manipulation og håndtering af mus, samt at levere en ensartet kvalitet i de billeder, der bruges til sygdom scoring. I hænderne på kvalificeret personlig, har vi fundet, at endoskopi inducerer ringe eller ingen skade på Tumors, der ville forårsage intratumoral blødning. For de terapeutiske protokoller, der er skitseret, mener vi endoskopi meget fordelagtig, da det giver en måde at bestemme den oprindelige tumor byrde, og giver os mulighed for at gruppere kohorter af dyr med lignende tumorbelastninger forud for indgivelse af et terapeutisk lægemiddel. Sekventiel overvågning af mus giver forskerne at fastlægge effekten af nye behandlingsformer tidligt, med mulighed for at opsige mislykkede eksperimenter i tide.Som vores forståelse af inflammatorisk tarmsygdom og kolorektal kræft forvejen, vil nye mål for behandling identificeres. Passende dyremodeller vil være integreret til at sikre, at de mest lovende nye behandlingsformer bevæges mod kliniske forsøg.
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank CSL Ltd. for supporting the purchase of the endoscopy equipment. The research in the laboratory of ME is supported by the Ludwig Institute for Cancer Research, and the laboratories of TP and ME are supported by the Victorian State Government Operational Infrastructure Support and the National Health and Medical Research Council of Australia. ME is an NHMRC Senior Research Fellow.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Dextran Sulfate Sodium (MW 36,000-50,000) | MP Biochemicals | 160110 | Requires batch testing. |
Azoxymethane | Sigma | A5486-100MG | Requires batch testing. |
Vanilla Protein Shake | N/A | N/A | Available from hospital pharmacies. |
Isoflourane | PPC | M60303 | This is a restricted reagent, which should be stored under lock and key. |
70% Ethanol | N/A | N/A | Standard lab reagent. |
Coloview miniendoscopic system | |||
Endovision Tricam | Karl Storz | 20212001-020 | |
Xenon 175 light source with anti-fog pump | Karl Storz | 20134001 | |
HOPKINS straight Forward Telescope | Karl Storz | 64301AA | |
Endoscopic Sheath (total diameter 3 mm) | Kalr Stroz | 61029C | |
Fubre Optic Light Cable | Kalr Stroz | 69495ND | |
Computer and media player software | MAC, imovies | ||
Scale | Any | Any scale suitable for weighing mice. |