评估癌症药物过敏的有效性<em>在体外</em>和<em>在体内</em
Summary
Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.
Abstract
由于异质性和固有的人类癌症，单一药剂的治疗或组合治疗方案靶向相同途径突变的水平高，很可能会失败。必须强调在通路是负责对疗法的固有和/或适应性阻力的抑制。调查的一个活跃的领域是开发和DNA修复抑制剂促进的作用，和防止抗，常用的化疗和放疗的测试。我们使用了一种新的协议，以评估BRCA2抑制的有效性，以敏感的肿瘤细胞对DNA损伤药物顺铂的装置。肿瘤细胞代谢（酸化和呼吸）实时一段72小时的划定上的分一秒基础治疗效果进行监测。在组合中，我们使用的是鸡胚胎绒毛尿囊膜（CAM）外渗及浸润模型进行转移频率的评估。此协议解决了一些常用的体外和体内方法来评价新的癌症治疗方案的弱点。它可以在除了常见的方法，例如细胞增殖试验，细胞死亡测定法中使用，并且在体内小鼠异种移植物的研究，以更紧密地辨别之间候选目标和剂，并仅选择最有前途的候选者的进一步发展。
Introduction
获得抗性靶向和/或细胞毒性癌症治疗的一个重要的临床问题，可导致治疗失败，复发，并增加患者的死亡率1。给定异质性的高水平，在大多数肿瘤中，它是一个具有足够高的细胞数的肿瘤将包含细胞抗单一或组合疗法靶向在其上的那些细胞赖以生存2,3-分子途径的子集的数学确定性。这样的肿瘤细胞可以在治疗过程中可靠地选择，从而导致疾病复发。新疗法，能同时针对不同的癌细胞存活机制之前或治疗介导的选择之后发展，因此是临床上重要的。
肿瘤基因组高水平的基因组不稳定和突变是区分癌细胞非肿瘤宿主细胞4根本特征。因此，一个usefu升的策略来增加DNA损伤化疗的效果，并防止耐药性的发展是积极抑制DNA修复中的肿瘤细胞5。这是调查和各种新的DNA修复的目标的一个活跃的领域正在探索在临床前设置。一些小分子或它们的靶的反义基抑制剂已经被开发并正在接受测试6-8。该目标是确定最有希望的临床前候选并评估其安全性和有效性的临床试验。
临床试验的成本高，失败的风险（为各种原因，包括亚最佳的临床前评估）是难以克服的障碍中的新疗法9发展进步。使用适当的和严格的临床前模型，以充分评估新的治疗靶点和候选药物可能会降低的临床试验10高故障率</suP>。
一些常用的临床前的方法来评估的新的抗癌疗法的功效是：a）测量能力，减少肿瘤细胞增殖在体外 （细胞增殖测定）中的肿瘤细胞的能力，二）治疗诱导减少的形式的组织培养的菌落（菌落形成测定法）中的肿瘤细胞的代谢活性，三）治疗诱导的减少在体外 （氧化还原染料的转换）中，d）治疗诱导的诱导体外肿瘤细胞死亡（凋亡，坏死，自噬相关联在体内有丝分裂及其他）11，和e）治疗诱导的减少生长人和小鼠异种移植物的12-14或消融。
列出的体外方法的一个主要弱点是，他们没有提供候选疗法的效果持续的实时评估。相反，他们只在选定的，广泛分隔时间点提供信息在治疗的过程中。这样的测量已经减少容量以准确地反映了肿瘤细胞应答的大小和定时。 体内小鼠异种移植模型也受限于成本高，时间来完成的长度，和亚最佳剂量和治疗时间（调度）的风险。此外，有证据表明，啮齿动物异种移植物模型是临床疗效在人类有限的预测相比， 在体外评估的原代人肿瘤细胞的应答，并建立了人肿瘤细胞系对候选治疗性干预15,16。
我们设计了一种新的组合协议来评估新的药物组合临床前，在解决了上面列出的更多的一般的步骤的弱点的方式。代替扩散，集落形成，或氧化还原染料转化测定中，我们利用了代谢测定单元来分析细胞粘附，呼吸，并实时酸化在整个治疗期间17。同时，我们通过使用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型的侵袭和转移18,19的研究体内治疗相结合的效果。我们使用这些方法来评价反义寡核苷酸（ASO）靶向BRCA2能增强常用化疗药物顺铂的有效性的能力。
Protocol
Representative Results
Discussion
由于与临床试验相关的固有的成本和风险，有必要开发更好的和更严格的临床前测试方法，以充分评估新的抗癌治疗方案。当前常用的技术都表现出弱点，这可能限制它们的潜在有希望的治疗靶标/剂之间进行区分的能力，以及那些可能不太有效。我们设计了一个协议，以评估新的抗癌方法，解决了许多传统方法的不足之处。
所描述的协议的一个特别重要的特征是，以实时测?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作成为可能，补助JK从卓越中心安大略省和安大略研究基金。
我们想拍摄期间感谢Siddika Pardhan和彼得·弗格森博士的技术援助。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' – UAAGGAACGUCAAGAGAUAC – 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco – Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen – Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
References
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