Evaluación de la efectividad del medicamento para el cáncer Sensibilización<em> In Vitro</em> Y<em> En Vivo</em
Summary
Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.
Abstract
Debido al alto nivel de heterogeneidad y las mutaciones inherentes en los cánceres humanos, las terapias con agentes individuales, o regímenes de combinación que se dirigen a la misma vía, son propensos a fallar. Se debe poner énfasis en la inhibición de las vías que son responsables de la resistencia intrínseca y / o de adaptación a la terapia. Un campo activo de investigación es el desarrollo y prueba de los inhibidores de reparación del ADN que promueven la acción de, y prevenir la resistencia a, comúnmente utilizado la quimioterapia y la radioterapia. Se utilizó un nuevo protocolo para evaluar la eficacia de la inhibición de BRCA2 como un medio para sensibilizar a las células tumorales al medicamento cisplatino que daña el ADN. Metabolismo de la célula tumoral (la acidificación y la respiración) se monitorizó en tiempo real por un período de 72 horas para delinear la efectividad del tratamiento en un minuto a minuto. En combinación, se realizó una evaluación de la frecuencia metastásica utilizando una membrana corioalantoidea de embrión de pollo (CAM) modelo de la extravasación y la invasión. Esteprotocolo aborda algunas de las debilidades de los comúnmente utilizados in vitro y métodos in vivo para evaluar los regímenes de terapia del cáncer novedosas. Se puede utilizar además de los métodos comunes tales como ensayos de proliferación celular, ensayos de muerte celular, y estudios in vivo de xenoinjertos murinos en, discriminar más estrechamente entre los objetivos de candidatos y agentes, y seleccionar sólo los candidatos más prometedores para el desarrollo futuro.
Introduction
Resistencia al objetivo y / o el tratamiento del cáncer citotóxica es un problema clínico importante que puede conducir al fracaso del tratamiento, recaída adquirida, y el aumento de la mortalidad del paciente 1. Dado el alto nivel de heterogeneidad en la mayoría de los tumores, es una certeza matemática que un tumor del número de células suficientemente alto contendrá un subconjunto de células resistentes a las terapias simples o combinadas dirigidas a las vías moleculares en que dichas células dependen para su supervivencia 2,3. Tales células tumorales pueden ser seleccionados positivamente para durante el tratamiento, dando lugar a recurrencia de la enfermedad. Desarrollo de nuevas terapias que se dirigen simultáneamente diferentes mecanismos de supervivencia de células cancerosas, ya sea antes o después de la selección del tratamiento mediada, por lo tanto es clínicamente importante.
Un alto nivel de inestabilidad del genoma y la mutación en los genomas tumorales es una característica fundamental que distingue a las células cancerosas de las células huésped no tumorales 4. En consecuencia, un useful estrategia para aumentar la eficacia de la quimioterapia que daña el ADN y para prevenir el desarrollo de resistencia es para inhibir activamente la reparación del ADN en las células tumorales 5. Este es un campo activo de investigación y una variedad de objetivos de reparación del ADN novedosas se están estudiando en un entorno pre-clínico. Una serie de pequeñas moléculas o inhibidores basados en antisentido de estos objetivos se han desarrollado y están en fase de pruebas 6.8. El objetivo es identificar los candidatos pre-clínicas más prometedoras y evaluar su seguridad y eficacia en los ensayos clínicos.
El alto costo de los ensayos clínicos y el riesgo de fracaso (para una variedad de razones, incluyendo la evaluación preclínica subóptima) son obstáculos formidables para progresar en el desarrollo de nuevas terapias 9. El uso de modelos apropiados y rigurosos pre-clínico para evaluar adecuadamente nuevas dianas terapéuticas y fármacos candidatos puede disminuir la alta tasa de fracaso de los ensayos clínicos 10 </sup>.
Algunos métodos de pre-clínicos utilizados comúnmente para evaluar la efectividad de los regímenes anti-cáncer novela son: a) medición de la capacidad para reducir la proliferación de células tumorales in vitro (ensayos de proliferación celular) b) reducción, inducida por el tratamiento en la capacidad de las células tumorales a colonias de cultivo de tejido forma (ensayos de formación de colonias), c) la reducción inducida por el tratamiento en la actividad metabólica de las células tumorales in vitro (conversión redox-dye), d) inducidos por la terapia de inducción de la muerte celular in vitro del tumor (apoptótico, necrótico, autophagic, asociado con la mitosis y otros) 11, y e) in vivo reducción del crecimiento o la ablación de humanos y de ratón xenoinjertos 12-14 terapia inducida.
Una debilidad importante de los métodos enumerados in vitro es que ninguno de ellos proporciona una evaluación continua en tiempo real de los efectos de las terapias candidatos. Más bien, ellos proporcionan información sólo a los puntos de tiempo seleccionados, ampliamente separadas-durante el curso del tratamiento. Tales medidas han disminuido la capacidad de reflejar con exactitud la magnitud y el momento de las respuestas de células tumorales. En vivo modelos de xenoinjertos de ratón también están limitados por el alto costo, la duración de tiempo en completarse, y el riesgo de dosificación y tratamiento momento subóptimo (programación). Además, hay evidencia de que los modelos de xenoinjerto de roedores son predictores limitados de eficacia clínica en humanos, en comparación con la evaluación in vitro de las respuestas de las células tumorales humanas primarias y establecidas las líneas celulares tumorales humanas a candidatos intervenciones terapéuticas 15,16.
Hemos ideado un nuevo protocolo de combinación para evaluar nuevas combinaciones de fármacos pre-clínica, de una manera que aborda las deficiencias de los procedimientos más comunes que se enumeran anteriormente. En lugar de la proliferación, la formación de colonias, o ensayos de conversión redox en colorantes, se utilizó una unidad de medición para analizar el metabolismo de la adhesión celular, la respiración, y la acidificación en tiempo realdurante todo el periodo de tratamiento de 17. Al mismo tiempo, se investigaron los efectos de la combinación de tratamiento in vivo mediante el uso de un embrión de pollo modelo corioalantoica membrana (CAM) de la invasión y la metástasis 18,19. Se utilizó estos métodos para evaluar la capacidad de un oligonucleótido antisentido (ASO) dirigidos BRCA2 para potenciar la eficacia del cisplatino fármaco quimioterapéutico comúnmente utilizado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Debido al coste inherente y el riesgo asociado con los ensayos clínicos, hay una necesidad de desarrollar una mejor y más rigurosa metodología de prueba pre-clínica para evaluar adecuadamente los regímenes de tratamiento contra el cáncer novedosas. Las técnicas actuales de uso común todas las debilidades de exposición que pueden limitar su capacidad para discriminar entre objetivos / agentes terapéuticos potencialmente prometedoras, y aquellos que pueden ser menos eficaces. Hemos elaborado un protocolo para ev…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo ha sido posible gracias a las subvenciones a JK de los Centros de Excelencia de Ontario y el Fondo de Investigación de Ontario.
Nos gustaría dar las gracias a Siddika Pardhan y el Dr. Peter Ferguson para la asistencia técnica durante el rodaje.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| A549 cells | ATCC | CCL-185 | http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx |
| AeraSeal film | Carl Roth GmbH | ||
| AMEM | Wisent Bioproducts | 210-011-QK | |
| Antisense oligodeoxynucleotides | Avecia | BRCA2 target sequence: 5' – UAAGGAACGUCAAGAGAUAC – 3' (bases 7241-7259 ) | |
| Axio Zoom V16 Microscope | Carl Zeiss | http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html | |
| Bionas Biosensor Chips | Bionas GmbH and Micronas GmbH | BIS8001D | |
| Bionas Discovery 2500 System | Bionas GmbH | http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ | |
| Cisplatin | Sigma Aldrich | 479306 | |
| Fertilized chicken eggs | Sourced locally | ||
| Fetal bovine serum | Gibco – Life Technologies | ||
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen – Life Technologies | 12566014 | http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html |
| PBS | Wisent Bioproducts | 311-010-CL | |
| Trypsin (0.25%)/EDTA | Wisent Bioproducts | 325-043-CL |
References
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