Summary

بروتوكول بسيطة وسريعة لغير إنزيمي فصل الطازجة الأنسجة البشرية لتحليل التسلل اللمفاويات

Published: December 06, 2014
doi:

Summary

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Abstract

يتم قبول قدرة الخلايا الخبيثة للتهرب من الجهاز المناعي، ويتميز ورم الهروب من كل من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية، والآن باعتبارها السمة المميزة مهمة من السرطان. أبحاثنا حول سرطان الثدي يركز على الدور الفعال الذي تلعبه الورم تسلل الخلايا الليمفاوية في تطور الورم ونتائج المرضى. لتحقيق هذا الهدف، وضعنا منهجية لعزل السريع للخلايا اللمفاوية سليمة من الأنسجة العادية وغير العادية في محاولة لتقييمها الداني إلى حالتها الأصلية. الخليط أعدت باستخدام عرض dissociator الميكانيكية على حد سواء زيادة سلامة وخلية الانتعاش مع الحفاظ على مستقبلات سطح التعبير مقارنة الأنسجة هضمها انزيم ل. وعلاوة على ذلك، لم الهضم الأنزيمي من المواد غير القابلة للذوبان المتبقية لا يتعافى CD45 + خلايا إضافية تشير إلى أن القياسات الكمية والنوعية في جناسة الأساسي من المرجح أن تعكس بصدق تسلل مجموعات سكانية فرعية في fragm الأنسجةوالأنف والحنجرة. الخلايا اللمفاوية في هذه الخليط يمكن أن يكون بسهولة تتميز باستخدام المناعية (النمط الظاهري، والانتشار، وغيرها) أو الجزيئية (DNA، RNA و / أو البروتين) النهج. ويمكن أيضا خلايا CD45 + أن تستخدم لتنقية حيوانية، والتوسع في المختبر أو الحفظ بالتبريد. فائدة إضافية لهذا النهج هو أن طاف النسيج الأساسي من الخليط يمكن استخدامها لتوصيف ومقارنة السيتوكينات، كيموكينات، والمناعية المستضدات الموجودة في الأنسجة الطبيعية والخبيثة. وينبغي لهذه الوظائف البروتوكول بشكل جيد للغاية لأنسجة الثدي الإنسان وتكون قابلة للتطبيق لمجموعة واسعة من أنسجة طبيعية وغير طبيعية.

Introduction

The tumor microenvironment is composed of various cell types with numerous studies showing they each play distinct and important roles in tumorigenesis1,2. These include, but are not limited to, infiltrating immune cells, stromal cells, endothelial cells and tumor cells3. Ex vivo studies of tumor infiltrating lymphocytes (TIL; CD45+ cells or leukocytes, which are predominantly lymphocytes in breast tumors) from fresh human tissue samples is made difficult by their low frequency, the small sample sizes often available for research and the potential for loss of viability during extraction. Because immune cells infiltrating tumors are usually present as passengers rather than permanent residents in general they are easier to release from the tissue matrix.

Dissociating tumor tissue while maintaining cellular integrity is technically challenging and has traditionally been performed using a combination of mechanical and enzymatic steps to prepare single cell suspensions4-8. This approach involves lengthy incubation periods and is associated with a significant reduction in cell viability as well as the loss of cell surface receptors by enzymatic cleavage. High quality flow cytometric studies characterizing TIL in the tumor microenvironment as well as clean purifications of CD45+ subpopulations by flow cytometry or antibody-coated beads are more difficult to achieve from enzyme-digested tumor tissue. In addition, the supernatant (SN) from the resulting tumor homogenate is not amenable to further analysis including quantification of secreted proteins (cytokines, chemokines, immunoglobulins or tumor antigens) or experimental treatment of normal cells, because of the potential for protein degradation in the enzymatic digests.

In our search for a method to prepare single cell homogenates from breast tissues [including tumor, non-adjacent non-tumor (NANT) and normal (from mammary reductions) breast tissues] without enzymatic digestion, we tested a variety of mechanical homogenization techniques. Homogenates prepared using a mechanical dissociator had increased cell viability (2-fold) and total cell recovery (2-fold) while preserving surface receptor expression. Enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells suggesting they were all released in the initial homogenate. Thus, this rapid and simple approach allows both qualitative and quantitative assessment of the CD45+ subpopulations present in various normal and malignant human tissues. An added advantage of this approach is that the SN from the initial homogenate (primary tissue SN) can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Protocol

ملاحظة: تم الحصول على جميع العينات باستخدام بروتوكول افقت عليها لجنة الأخلاقيات الطبية من معهد جول بورديه مع الموافقة المسبقة الخطية التي تم الحصول عليها من كل مريض. 1. إعداد جناسة الأنسجة <li style=";text-align:right…

Representative Results

الهضم الأنزيمي من شظايا الأنسجة مع أي من الحلول المتاحة تجاريا تفارق الأنسجة أو مخاليط مختبر مختلفة من كولاجيناز، الدناز و / أو مثبطات هيالورونيداز، يلتصق مجموعة واسعة من المستقبلات على سطح الخلايا. لدينا دراسات، ركزت في البداية على خلايا CD4 + T التسلل أورام الث…

Discussion

توضح هذه الدراسة طريقة الأمثل لإعداد السريع من الخليط أنسجة الثدي العادية والخبيثة دون الهضم الأنزيمي للفرز لاحق الخلية، والاستخراج، والحفظ بالتبريد و / أو تحليل المظهري من CD45 + القطعان. والهدف من هذا النهج التجريبي لإنتاج صور للسمسم التي تعكس بشكل وثيق دولتهم…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

كان مدعوما من المنح هذا العمل fromthe صندوق البلجيكي للبحوث العلمية (FNRS)، LES AMIS DE L'معهد بورديه، FNRS في العملية Télévie، سرطان خطة بلجيكا، فون مبو]-Marteaux، فون JC Heuson وفون برسي.

Materials

Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GentleMacs Dissociator  Miltenyi Biotec 130-093-235 BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R Eppendorf N/A or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R Eppendorf N/A or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet ESCO global N/A or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope Nikon eclipse TS100 N/A or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber Marienfield  640210 or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer Beckman Coulter N/A or other flow cytometer (8-10 color recommended)
Materials Company Catalog Number Comments/Description
GentleMacs C-Tube Miltenyi Biotec 130-096-344 BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish Sarstedt 72,710 or other non-pyrogenic plasticware 
Disposable Scalpel Swann-Morton 0510 or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40µm Becton Dickinson 734-0002 or other non-pyrogenic plasticware 
BD Falcon Tube 50mL Becton Dickinson 352070 or other non-pyrogenic plasticware 
BD Falcon Tube 15mL Becton Dickinson 352097 or other non-pyrogenic plasticware 
BD FACS Tube 5mL Becton Dickinson 352008 or other non-pyrogenic plasticware 
Sterile Pasteur Pipette 5 mL  VWR 612-1685 or other non-pyrogenic plasticware 
Microfuge Tube 1.5 mL Eppendorf 7805-00 or other non-pyrogenic plasticware 
Reagents Company Catalog Number Comments/Description
X-Vivo 20 Lonza BE04-448Q serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline Lonza BE17-516F standard physiological PBS
Trypan blue  VWR 17942E or other vital stain
VersaLyse Beckman Coulter A09777 for flow cytometry experiments
Fixable viability Dye eFluor 780  eBioscience 65-0865-14 for flow cytometry experiments
anti-CD3 FITC BD Biosciences 345763 for flow cytometry experiments
anti-CD3 Vio Blue Miltenyi Biotec 130-094-363 for flow cytometry experiments
anti-CD4 PE BD Biosciences 345769 for flow cytometry experiments
anti-CD4 APC Miltenyi Biotec 130-091-232 for flow cytometry experiments
anti-CD8 ECD Beckman Coulter 737659 for flow cytometry experiments
anti-CD8 PerCP BD Biosciences 345774 for flow cytometry experiments
anti-CD19 APC-Vio770 Miltenyi Biotec 130-096-643 for flow cytometry experiments
anti-CD45 VioGreen Miltenyi Biotec 130-096-906 for flow cytometry experiments

References

  1. Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
  2. Boudreau, A., van’t Veer, J. L., Bissell, M. J. An ‘elite hacker’: breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity. Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).
  3. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  4. Quezada, S. A., et al. Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma. J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).
  5. Grange, C., et al. Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation. J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).
  6. McCauley, H. A., Guasch, G. Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension. Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).
  7. Gros, A., et al. Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma. Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).
  8. Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies. J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).
  9. Gu-Trantien, C., et al. CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).
  10. Buisseret, L., et al. Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
  11. Garaud, S., et al. Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 18 (2014).
  12. Gu-Trantien, C., et al. Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
  13. Yee, C. The use of endogenous T cells for adoptive transfer. Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).
  14. Butler, M. O., et al. Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help. PLoS One. 7 (1), 30229 (2012).
  15. Ye, Q., et al. Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes. J Transl Med. 9, 131 (2011).

Play Video

Cite This Article
Garaud, S., Gu-Trantien, C., Lodewyckx, J., Boisson, A., De Silva, P., Buisseret, L., Migliori, E., Libin, M., Naveaux, C., Duvillier, H., Willard-Gallo, K. A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes. J. Vis. Exp. (94), e52392, doi:10.3791/52392 (2014).

View Video