एक सह-संस्कृति प्रणाली में neuronal कनेक्शन के गठन का आकलन करने के लिए एक optogenetic दृष्टिकोण
Summary
A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.
Abstract
Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.
Introduction
हाल के वर्षों में, न्यूरॉन और neuronal सर्किट समारोह के बारे में हमारी समझ neuronal excitability कि नियंत्रण कई optogenetic उपकरण द्वारा क्र ांतिकारी परिवर्तन किया गया है। ऐसा ही एक उपकरण प्रकाश सक्रिय कटियन चैनल है, channelrhodopsin-2 (ChR2): प्रकाश उत्तेजना 1-3 के जवाब में ChR2 आग कार्रवाई क्षमता व्यक्त न्यूरॉन्स। न्यूरॉन्स रोशनी करने के लिए आमतौर पर संवेदनशील नहीं होते हैं, क्योंकि यह उल्लेखनीय क्षमता न्यूरॉन्स 4 की आनुवंशिक रूप से परिभाषित आबादी की गतिविधि के सटीक अस्थायी और स्थानिक नियंत्रण के लिए नए रास्ते खुल जाता है और बहुत मस्तिष्क समारोह के अध्ययन में तेजी आई है। ChR2 तंत्रिका नेटवर्क 6 की गतिविधि को विनियमित करने के लिए neuronal विकास 5 की निगरानी से, विभिन्न प्रयोजनों के लिए स्टेम सेल शोध के लिए लागू किया गया है।
यहाँ हम एक neuronal सह संस्कृति प्रणाली की उपयोगिता बढ़ाने के लिए ChR2 इस्तेमाल किया। सह संस्कृति प्रणालियों विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच बातचीत का आकलन कर सकें।न्यूरॉन्स और glia के सह संस्कृतियों, तंत्रिका तंत्र के मुख्य प्रकार की कोशिकाओं, आमतौर पर इन विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के बीच संकेत जांच करने के लिए, साथ ही शारीरिक प्रतिक्रियाओं के लिए इस संकेतन के महत्व का मूल्यांकन करने, क्षति के प्रचार-प्रसार और जांच करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं संभवतः इस सात संकेत में शामिल कर रहे हैं कि आणविक तंत्र। पिछले एक अध्ययन मानव IPSCs चूहे कॉर्टिकल प्राथमिक संस्कृति युक्त न्यूरॉन्स, astrocytes, oligodendrocytes, और microglia 8 की उपस्थिति में न्यूरॉन्स में बहुत जल्दी में अंतर का पता चला।
इस प्रोटोकॉल में, हम मानव प्रेरित स्टेम कोशिकाओं (IPSCs) से ली गई चूहा cortical न्यूरॉन्स और न्यूरॉन्स के बीच synaptic कनेक्शन से पूछताछ करने के लिए एक सह संस्कृति प्रणाली में ChR2 इस्तेमाल करता है कि एक विधि प्रदर्शित करता है। हम astrocytes में काटना करने के लिए कदम और फसल मस्तिष्क के ऊतकों 9 के साथ ही माउस तंत्रिका पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं को बनाए रखने और अलग करने के लिए (NPCs) का वर्णन है और मानव NPCs के intओ न्यूरॉन्स सह संस्कृति प्रणाली बनाने के लिए। इस सह-संस्कृति प्रणाली स्थापित करने के लिए, हम Okita एट अल द्वारा वर्णित एकीकरण मुक्त reprogramming विधि का इस्तेमाल किया। 10 मानव IPSCs उत्पन्न करने के लिए। ली एट अल द्वारा वर्णित के रूप में इन IPSCs फिर कुशलता से छोटे अणु अवरोधकों का उपयोग कर रासायनिक परिभाषित स्थितियों में NPCs में भेदभाव कर रहे थे। 11
सह-संस्कृतियों में, न्यूरॉन्स के विभिन्न आबादी टमाटर (tdTomato) डिमर फ्लोरोसेंट प्रोटीन, मिलकर माध्यम IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की cortical न्यूरॉन्स में ChR2 अभिव्यक्ति का पता लगाने और टैगिंग के माध्यम से पहचाना जा सकता है। Cortical न्यूरॉन्स की optogenetic photostimulation साथ IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स से electrophysiological रिकॉर्डिंग के संयोजन एक दूसरे के साथ सर्किट के लिए फार्म न्यूरॉन्स के इन दो प्रकार की क्षमता के आकलन के लिए अनुमति देता है। विशेष रूप से, cortical न्यूरॉन्स ChR2 व्यक्त की photostimulation अन्तर्ग्रथनी सर्किट का गठन किया है कि IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में synaptic प्रतिक्रियाओं का आह्वानphotostimulated cortical न्यूरॉन नेटवर्क के साथ। हम वृद्धि हुई पोस्टअन्तर्ग्रथनी धाराओं वास्तव में इस तरह की स्थितियों के तहत IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में पता चला रहे हैं कि प्रदर्शित करता है। इस प्रोटोकॉल रोग के रोगियों से fibroblasts से व्युत्पन्न IPSCs का उपयोग करके विभिन्न न्यूरोलॉजिकल बीमारी मॉडलों की आवृत्ति सहित प्रयोगात्मक शर्तों, की एक किस्म के तहत synaptic circuitry के मूल्यांकन की अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
Optogenetics न्यूरॉन्स 13 से परिभाषित आबादी के क्रियान्वयन के लिए अस्थायी और स्थानिक सटीक प्रदान करता है। हमारे प्रयोगों में, खुर्दबीन उद्देश्य के पूरे क्षेत्र ChR2 व्यक्त तस्वीर को प्रोत्साहित ही cortical न्यूरॉन्स के लिए 30 सेकंड के लिए प्रकाशित किया गया था। इस synaptic कनेक्शन सह संस्कृति के भीतर न्यूरॉन्स के विभिन्न आबादियों के बीच का गठन किया गया है कि क्या हमें यह निर्धारित करने की अनुमति दी। हमारे परिणाम photostimulation इन न्यूरॉन्स ChR2 व्यक्त प्रीसानेप्टिक cortical न्यूरॉन्स से synaptic इनपुट प्राप्त यह दर्शाता है कि जो, IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स में पीएससी आवृत्ति बढ़ जाती है कि पता चला। यह, बारी में, IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स सफलतापूर्वक cortical न्यूरॉन्स के साथ सर्किट में शामिल है कि स्थापित किया।
इस सह-संस्कृति प्रणाली की पीढ़ी के लिए कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। यह चढ़ाना के साथ आगे बढ़ने से पहले माउस एनपीसी व्युत्पन्न अस्थिकणिका संस्कृतियों, न्यूनतम कोशिका मृत्यु के साथ, स्वस्थ रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैअन्य प्रकार की कोशिकाओं की। Cortical न्यूरॉन्स और मानव NPCs के स्वस्थ astrocytes पर अच्छी तरह से देते हैं और electrophysiological रिकॉर्डिंग संस्कृति शर्तों पर भारी निर्भर करते हैं। इस प्रोटोकॉल में अन्य महत्वपूर्ण कदम अस्थिकणिका संस्कृतियों पर electroporation और cortical न्यूरॉन्स की चढ़ाना हैं। कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या electroporation के बाद मर जाते हैं, यह कम से कम 6 लाख cortical न्यूरॉन्स 24 अच्छी तरह से प्लेट में अस्थिकणिका संस्कृतियों पर चढ़ाना के लिए electroporated कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। हम कम से कम 6 मिलियन कोशिकाओं electroporated थे, जब जीवित रहते हैं कि न्यूरॉन्स की संख्या electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रभावित जो एक घने neuronal नेटवर्क, फार्म नहीं था कि मनाया है। प्रत्येक सह संस्कृति प्रयोग विभिन्न अध्ययनों के बीच तुलना की अनुमति देने के लिए electroporated cortical न्यूरॉन्स की संख्या भी अनुरूप होना चाहिए। Enzymatic पाचन से जुड़े सभी चरणों के लिए, यह बहुत लंबा यह सेल मौत का कारण हो सकता है के रूप में के लिए पाचन समाधान में कोशिकाओं को छोड़ने के लिए आवश्यक नहीं है।
यहदृष्टिकोण अन्य न्यूरॉन्स के साथ synaptic संपर्कों के लिए फार्म रोगी विशेष fibroblasts से व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की क्षमता स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Neurodevelopmental विकार Rett सिंड्रोम (RTT) से पीड़ित रोगियों से fibroblasts से व्युत्पन्न न्यूरॉन्स synaptic प्रसारण दोष दिखा रहे हैं: RTT न्यूरॉन्स, शायद के कारण कम synaptic कनेक्टिविटी से 14 स्वस्थ न्यूरॉन्स की तुलना में पीएससी आवृत्ति और आयाम में एक महत्वपूर्ण कमी दिखा रहे हैं। हमारे सह-संस्कृति प्रणाली विकास संबंधी दोषों को प्रदर्शित करने न्यूरॉन्स पर दवा प्रभाव की परीक्षा की अनुमति देता है। यह रोगग्रस्त मानव NPCs के बोने के दौरान के रूप में अच्छी तरह से neuronal भेदभाव के समय के दौरान यौगिकों के लिए निरंतर प्रदर्शन के दौरान ब्याज की यौगिकों के अलावा के माध्यम से बाहर किया जा सकता है।
इस सह-संस्कृति प्रणाली भी दवा के परीक्षण के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, इस दृष्टिकोण के साथ एक सीमा प्रत्येक उम्मीदवार परिसर के प्रभाव की जांच की प्रक्रिया लंबी और के रूप में कठिन हो सकता हैयह एक उच्च throughput स्क्रीनिंग विधि नहीं है। उम्मीदवार यौगिकों के साथ उपचार के बाद, IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स को व्यक्तिगत रूप से पीएससी पर प्रत्येक परिसर के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए समझौता किया जाना है। इसके अलावा, वर्तमान में रोगियों से नहीं कई उपलब्ध fibroblasts और IPSCs कर रहे हैं। इसलिए, यह अधिक मरीज की कोशिकाओं के लिए है और यह भी उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुकूल करने के लिए निकट भविष्य में ब्याज की हो जाएगा। उदाहरण के लिए, इस तरह के आयनों या झिल्ली क्षमता की आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सेंसर के रूप में एक गतिविधि सूचक के साथ IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स, लेबलिंग के द्वारा, यह पक्ष निकलते समय लेने वाली electrophysiological प्रक्रिया से काफी throughput दर को बढ़ाने के लिए संभव हो जाएगा। Electrophysiological रिकॉर्डिंग प्रदर्शन करने fibroblasts के reprogramming से, इस सह-संस्कृति प्रणाली पैदा करने की पूरी प्रक्रिया के रूप में, 90 से अधिक दिनों, यह क्रमशः reprogramming और तंत्रिका प्रेरण कदम के बाद, मानव IPSCs या NPCs के लिए या तो विस्तार किया जा सिफारिश की है कि आवश्यकता है,और cryopreserved भविष्य प्रयोगों के लिए आवश्यक समय को कम करने के लिए।
हमारे प्रयोगों में, हम synapsin1 प्रमोटर के तहत cortical न्यूरॉन्स में ChR2 व्यक्त किया। इस प्रमोटर अखिल neuronal है, क्योंकि हम संभवतः दोनों निरोधात्मक और उत्तेजक cortical न्यूरॉन्स photostimulating थे। भविष्य प्रयोगों के लक्ष्य को विशेष रूप से निरोधात्मक या उत्तेजक या तो सर्किट से पूछताछ करने के लिए है, तो अधिक विशिष्ट प्रमोटरों इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, cortical न्यूरॉन्स ट्रांसजेनिक (या वायरस इंजेक्शन चूहों) ChR2 अभिव्यक्ति विशेष रूप से न्यूरॉन्स की आनुवंशिक रूप से परिभाषित उप-जनसंख्या के लिए लक्षित है जहाँ से प्राप्त किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, Cre recombinase है कि एक माउस से कटाई कॉर्टिकल ऊतकों ChR2 व्यक्त केवल cortical न्यूरॉन्स पीवी interneurons 15 हो जाएगा, जहां एक की स्थिति निकलेगा floxed ChR2 के साथ एक माउस के साथ पार कर जाता है कि parvalbumin युक्त interneurons (पीवी interneurons) में व्यक्त की है। ऐसे ChR2 व्यक्त हमारे में से interneurons सह-घन के उपयोगlture प्रणाली एक समझौता IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन पीवी interneurons के साथ एक सर्किट में शामिल करने में सक्षम है या नहीं के निर्धारण के लिए सक्षम हो जाएगा।
पिछले एक अध्ययन 9 के आधार पर, cortical न्यूरॉन्स इन विट्रो में 14 दिनों के बाद डेन्ड्राइट ओवरलैपिंग के साथ परिपक्व हो रहे हैं। Photostimulation एक समझौता IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन से एक प्रतिक्रिया प्रकाश में लाना नहीं है, तो इस प्रकार, यह न्यूरॉन cortical न्यूरॉन्स के साथ synaptic कनेक्शन बनाने की क्षमता नहीं है जो संकेत चाहिए। एक IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन अन्य IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स या cortical न्यूरॉन्स से या तो सिनेप्टिक इनपुट प्राप्त करने में सक्षम है। पारंपरिक पैच दबाना रिकॉर्डिंग का उपयोग किया गया है, यह synaptic इनपुट से आ रही है जहां भेद करने के लिए संभव नहीं होगा। हमारी प्रणाली का लाभ कॉर्टिकल प्रीसानेप्टिक इनपुट से पोस्टअन्तर्ग्रथनी प्रतिक्रियाओं चुनिंदा पैदा की और पहचाना जा सकता है। यहां उल्लिखित प्रक्रियाओं को एकीकृत करने के IPSC व्युत्पन्न न्यूरॉन्स की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण प्रदानएक परिभाषित न्यूरोनल नेटवर्क में।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम IPSC पीढ़ी पर विशेषज्ञता और प्रोटोकॉल साझा करने के लिए क्रमश: ChR2 और Synapsin1-tdTomato lentiviral निर्माणों के लिए सी चाय लालकृष्ण Deisseroth और एस जे धन्यवाद, WY Leong तकनीकी सहायता के लिए, साझा अभिकर्मकों और विशेषज्ञता के लिए गोह प्रयोगशाला के सदस्य हैं। इस काम ELG करने के लिए अपने प्रतिस्पर्धी अनुसंधान कार्यक्रम (002-082 2008 एनआरएफ-सीआरपी एनआरएफ) के तहत नेशनल रिसर्च फाउंडेशन सिंगापुर से, एबट पोषण और ELG करने के लिए उत्कृष्टता के शैक्षणिक केंद्र (ऐस) ग्लैक्सोस्मिथक्लाइन (जीएसके) से अनुसंधान पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था और GJA, और शिक्षा, विज्ञान और कोरिया की प्रौद्योगिकी (MEST) मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित कोरिया के राष्ट्रीय अनुसंधान फाउंडेशन के वर्ल्ड क्लास संस्थान (WCI) प्रोग्राम (एनआरएफ) द्वारा (एनआरएफ अनुदान संख्या: WCI 2009-003) GJA को
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Neurocult Proliferation Kit (Mouse) | STEMCELL Technologies | 5702 | Contains NSC Basal Medium and NSC Proliferation Supplement |
| Epi5 Episomal iPSC Reprogramming Kit | Invitrogen | A15960 | |
| DMEM/F12 | Lonza | 12719F | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Neurobasal medium | Invitrogen | 21103049 | |
| MEM without glutamine | Invitrogen | 11090081 | |
| N2 | Invitrogen | 17502048 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| GlutaMAX supplement | Invitrogen | 35050061 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140122 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Human LIF | Invitrogen | PHC9484 | |
| CHIR99021 | Miltenyi Biotech | 130103926 | |
| SB431542 | Sigma | S4317 | |
| Compound E | Merck Millipore | 565790 | |
| EGF | Merck Millipore | 324856 | |
| FGF2 | R&D Systems | 233FB025 | |
| Research Grade FBS | Thermo Scientific | SV30160.03 | For astrocyte differentiation medium |
| Defined FBS | Thermo Scientific | SH30070.03 | For primary neuron medium |
| PBS | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | For primary neuron medium |
| Sucrose | Sigma | S0389 | |
| Heparin | EMD Millipore | 375095 | |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| HBSS | Invitrogen | 14175095 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Dispase II | STEMCELL Technologies | 7923 | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | For harvesting brains |
| EBSS | Invitrogen | 14155063 | |
| L-Cysteine | Sigma | C7352 | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 70 µm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| 20 µm filter unit | Sartorius Stedim | 16534K | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
| NaH2PO4 | Fluka | 71505 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| D(+)-Glucose | Sigma | G7520 | For electrophysiological studies |
| K-gluconate | Sigma | P1847 | |
| KOH | KANTO Chemical | 3234400 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | For electrophysiological studies |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma | A7699 | |
| Na3GTP | Sigma | G8877 | |
| Borosilicate glass capillaries | World precision instruments, Inc | 1604323 | |
| 15 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml centrifuge tube | BD Biosciences | 352070 | |
| 24-well plates | Corning | 9761146 | |
| 6-well plates | Corning | 720083 | |
| T25 flasks | Corning | 430641 | |
| 12 mm cover glasses | Marienfeld-Superior | 111520 | |
| AMAXA Rat Neuron Nucleofector Kit | Lonza | VPG1003 | For electroporation of primary cortical neurons |
| Neon Transfection System | Invitrogen | MPK5000 | For electroporation of human fibroblasts |
| Mini Analysis | Synaptosoft | Mini Analysis v.6 | For measurement of PSCs |
| Normal Dermal Human Fibroblasts | PromoCell | C12300 | |
| pLenti-Synapsin-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE | Addgene | 20945 | |
| Mercury short-arc lamp | OSRAM | HBO 103 W/2 | |
References
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