Radial Mobilität und zytotoxische Funktion der retroviralen Replikation von Vektor transduziert, Nichthaft Alloresponsive T-Lymphozyten
Summary
We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.
Abstract
Wir berichten über einen neuartigen Anpassung des Radialmonolayer-Zellmigrationsassay ersten gemeldet, um die radiale Migration von adhärenten Tumorzellen an extrazellulären Matrixproteinen zu messen, zur Messung der Beweglichkeit der fluoreszierend markierten, nicht-adhärente humane oder murine Effektor Immunzellen. Diese Technik verwendet ein nichtrostender Stahl und vielfältigen 10-Well-Teflon-Folie, um fokal einzahlen nicht haftende T-Zellen in die Vertiefungen entweder konfluent Tumorzellmonoschichten oder extrazellulären Matrixproteinen vorbereitet. Licht und / oder Mehrkanal-Fluoreszenz-Mikroskopie verwendet wird, um die Bewegung und das Verhalten der Effektorzellen über die Zeit verfolgen. Fluoreszenzfarbstoffe und / oder virale Vektoren, die Code für fluoreszierende Transgenen verwendet werden, um differentiell zu markieren, die Zelltypen für die Bildgebung. Diese Methode unterscheidet sich von ähnlichen Typs in-vitro-Tests, die horizontale oder vertikale Migration / Invasion Verwendung Schiebekammern, Agar oder Transwell-Platten zu verfolgen. Der Test ermöglicht die detaillierte Bilddaten zu be mit verschiedenen Zelltypen mit spezifischen Fluoreszenzmarkern unterschieden gesammelt; sogar spezifische Subpopulationen von Zellen (dh transduziert / transduzierten) überwacht werden kann. Oberflächen Intensität Fluoreszenz Grundstücke werden mit speziellen Fluoreszenzkanälen, die zu migrierenden Zelltyp entsprechen generiert. Dies ermöglicht eine bessere Visualisierung der nichthaftImmunZellMobilität zu bestimmten Zeiten. Es ist auch möglich, Belege für andere Effektorzelle Funktionen wie Zytotoxizität oder der Übertragung von viralen Vektoren, die von Effektorzellen zu Zielzellen zu sammeln, als auch. Somit ermöglicht das Verfahren die Forscher mikroskopisch dokumentieren Zell-zu-Zell-Wechselwirkungen von differentiell markierten, nicht-haftend mit adhärenten Zellen verschiedener Typen. Solche Informationen können besonders relevant bei der Beurteilung von biologisch manipuliert oder aktivierten Immunzelltypen, wo visuelle Nachweis der Funktionsfähigkeit mit Tumorzielzellen vor ihrer Verwendung zur Krebstherapie erwünscht.
Introduction
Der Radial Monolayer-Zellmigrationsassay wurde ursprünglich entwickelt, um die Infiltrationseigenschaften von adhärenten Tumorzellen 1-4 auf Objektträger mit der extrazellulären Matrix (ECM) Proteine 5-7 oder mit einzelnen ECM-Komponenten, wie Fibronectin oder Laminin 1,2 beschichtet messen. Die Technik involviert Animpfen einer Einzelzellsuspension von Tumorzellen in der Mitte der Vertiefungen unter Verwendung eines Edelstahl Zellsedimentation Verteiler (CSM). Nach Sedimentation würden die Tumorzellen an der Unterseite der Wanne und der Änderung des Durchmessers des anfänglichen Zellpopulation im Laufe der Zeit festhalten wurde verwendet, um eine Rate der horizontalen Beweglichkeit herzustellen. Die Radial Monolayer Zellmigration Test vorgesehen eine visuelle Vorteil gegenüber anderen existierenden Methoden, die Transwell-Platten, die in-vitro-Migrationsfunktionen von Zellen zu untersuchen beschäftigt; diese Tests sind nicht förderlich für die Bildgebung 8. Wie gut, sondern auch bei der Auswahl der vorgesehenen Zeitpunkt eine große Menge an Freiheits, wenn die Migration untersucht, ohne Begrenzung auf die Anzahl der Zeitpunkte ein Forscher könnte nach der Sedimentation zu Bild auszuwählen.
Weil die Migrationsfähigkeit ist eine wichtige Funktion für die nicht-anhaftenden Zellen, insbesondere auf dem Gebiet der Immuntherapie oder wo sie als Abgabevehikel für virale Vektoren verwendet werden, geeignet ist der Einsatz der CSM, die Migration von nicht-adhärenten Zellen zu bewerten Typen auf Tumorzellschichten, zusätzlich zu den ECM-Proteine. Der zusätzliche Vorteil der mikroskopisch Visualisierung der Migration von nicht-adhärenten Zellen zu lebensfähigen Tumorzellschichten, auf komplexen ECM aus dem Tumor oder an einzelnen ECM Komponenten isoliert macht dieses Assay vielseitig. Assays, die Vertiefungen, die mit einem einzigen extrazellulären Protein beschichtet beschäftigen nicht genau weiß das ECM-Gewebesubstrat oder Tumor die Zellen würden durch in vivo zu migrieren.
Hier haben wir alloreaktiven zytotoxische T-Lymphozyten (alloCTL), zu den wichtigsten histocomp sensibilisiertatibility Komplex (MHC) -Proteinen mit Einweg gemischten Lymphozytentumorzellreaktionen (MLTR) oder gemischten Lymphozytenreaktionen (MLR) 9, wie unsere repräsentative nicht-adhärenten Zelltyp. Wir testeten Zellen der menschlichen und murinen Ursprungs. Bei der Migration wurde auf Tumormonoschichten gemessen, waren die Tumorzellen eingesetzt entweder teilweise relevanten Ziele und zeigt einige der gleichen MHC-Proteinen auf der Zellpopulation verwendet, um die Effektoren oder vollständig relevanten Ziele, mit einem kompletten Satz von MHC-Molekülen zu sensibilisieren gestellt, dass die Effektoren hatte gegen sensibilisiert. In einigen Experimenten wurden fluoreszierende Celltracker Red CMPTX oder Zellproliferation Farbstoff eFluor 670 zwischen Effektor- und Zielzellen zu unterscheiden. Wir haben auch die Transduktion mit viralen Vektoren Codierung für fluoreszierende Proteine als weitere Möglichkeit, um die Zellen zu visualisieren. Für bestimmte Tests, transduziert wir die alloCTL mit retroviralen Vektoren zu replizieren (RRV) für Emerald Green (EMD) fluoreszierendes Protein kodierende 10,11; für othten, wurden Tumorzellen mit lentiviralen Vektoren für mStrawberry Codierungs transduziert.
Die alloCTL wurden durch einen Kanal des Verteilers in die Mitte der beiden Tumorzellschichten oder ECM aus Tumorzellmonolayer geerntet ausgesät. Adhärenten und nicht-adhärenten Zell Wechselwirkungen wurden durch Licht und / oder durch Fluoreszenzmikroskopie im Laufe der Zeit sichtbar. Störung in der Tumorzellschicht mit geringer Leistung oder Tumorzellen mit fragmentierten Kernen mit hoher Leistung waren Indikatoren der Zellschädigung durch Lyse und Apoptose auf. Wir digital erstellt Oberfläche Intensität fluoreszierender Karten, auf denen die Migration von nicht-haftenden fluoreszierenden T-Zellen in den Monolayer-Kulturen. Wir haben auch darauf hingewiesen, die Zytotoxizität erzeugt, um die adhärenten Gliom-Zellmonolayer nach Clusterbildung der überlagerten nicht haft alloCTL. Wie gut, horizontal Transduktion RRV-EMD von der alloCTL auf die Gliom Monolage beobachtet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tumorzellen in einem Einzelzellsuspension wurden in die Vertiefungen einer Teflon-maskiert Schieber pipettiert. Man ließ die Zellen anhaften und dann in einer befeuchteten 5% CO 2, 37 ° C-Inkubator (1A) gebildete Monoschichten. Etablierte Monoschichten oder ECM-Proteine aus der Monoschicht abgeleitet könnte für diese Assays (1B) geerntet werden. Effektor-T-Lymphozyten mit vitalen Farbstoffen markiert oder mit Vektoren für EMD Codierungs transduziert wurden in der M…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Unterstützt teilweise durch NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI Förderkennzeichen UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734 und der Joan S. Holmes Memorial Research Fund. MJH und GCO erhielt von der Joan S. Holmes Memorial Postdoctoral Fellowship an der UCLA unterstützt. Die CSM-Gerät wurde von Creative Wissenschaftliche Methoden erhalten: www.creative-sci.com. Die lentiviralen Vektor wurde von der UCLA Vector Kern, der von CURE / P30 DK041301 unterstützt wird empfangen.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Teflon-masked microscope slides | Creative Scientific Methods | CSM002 | |
| Cell Sedimentation Manifold | Creative Scientific Methods | CSM001 | |
| Petri Dish, 150mm | Corning | 430597 | |
| Petri Dish, 35mm | Corning | 430588 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-040 | |
| 20 μL Pipetman | Gilson | F123600 | |
| 200 μL Pipetman | Gilson | F123601 | |
| 200 μL pipette tips | VWR | 89003-060 | |
| Distilled, deionized water (sterile) | Mediatech | 25-055 | |
| Trypsin | Mediatech | 25-054-CL | |
| Celltracker Red CMPTX | Invitrogen | C34552 | |
| TrypLE Express (optional) | Gibco | 12604 | |
| Tumor cell culture media (e.g. DMEM) | Mediatech | 10-013 | |
| AIM-V serum-free media | Invitrogen | 12055-083 | |
| Fetal Bovine Serum | Omega Scientific | FB-02 | |
| Inverted microscope | |||
| SPOT Advanced | Diagnostic Instruments | ||
| Poly-D-Lysine | Millipore | A-003-E | |
| Fibronectin | BD | 354008 | |
| 31/2 x 51/4 Autoclave Pouches | Crosstex | SCXS2 | |
| Trypan Blue | Mediatech | 25-900-CI | |
| Cell Proliferation eFluor 670 | eBioscience | 65-0840-85 | |
| ImageJ | NIH |
References
- Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells. Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).
- Valster, A., et al. Cell migration and invasion assays. Methods. 37 (2), 208-215 (2005).
- Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay. Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).
- Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells. Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).
- Berens, M. E., Beaudry, C. Radial monolayer cell migration assay. Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).
- Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. Determinants of human astrocytoma migration. Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).
- Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix. Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).
- Hulkower, K. I., Herber, R. L. Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery. Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).
- Hickey, M. J., et al. Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas. Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).
- Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma. Mol Ther. 12, 842-851 (2005).
- Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing. J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).
- Koya, R. C., et al. Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses. Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).
- Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation. J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).
- Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. 3-D extracellular matrix from sectioned human tissues. Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).
- Prevention, C. f. D. C. a. . Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).
- Alstergren, P., et al. Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44. Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis. BMC Immunol. 6 (12), 21 (2005).
- Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Automated real-time measurement of chemotactic cell motility. Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).
- Zhang, J. G., et al. Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy. J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).
