Influensa virus Formering i embryon Chicken Egg
Summary
Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.
Abstract
Influensainfeksjon er assosiert med ca 36.000 dødsfall og mer enn 200.000 sykehusinnleggelser hvert år i USA. Den kontinuerlige fremvekst av nye influensavirusstammer på grunn av mutasjon og re-sortiment kompliserer styringen av viruset, og nødvendiggjør permanent utvikling av nye medikamenter og vaksiner. Laboratoriet basert undersøkelse av influensa krever en pålitelig og kostnadseffektiv metode for formering av viruset. Her er en omfattende protokoll gitt for influensa A virus forplantning i frukt kylling egg, som konsekvent gir høy titer virus aksjer. I korte trekk, blir serum patogenfrie (SPF) befruktede kyllingegg inkubert ved 37 ° C og 55-60% fuktighet i 10 – 11 dager. Over denne perioden, kan embryo utvikling enkelt overvåkes ved hjelp av et egg Candler. Virus inokulering utføres ved injeksjon av viruslager inn i det allantoiske hulrom ved hjelp av en nål. Etter 2 dagers inkubasjon ved 37 ° C, egg erkjølt i minst 4 timer ved 4 ° C. Eggeskallet over luftsekken og chorioallantoic membranen blir deretter forsiktig åpnet, og den allantoiske væske som inneholder virus blir høstet. Væsken blir fjernet fra rester ved sentrifugering, delt i porsjoner, og overført til -80 ° C for lagring over lang tid. Den store mengder (5-10 ml av virusholdige væske per egg) og høyt virustiter som vanligvis oppnås med denne protokoll har gjort bruk av egg for virus-preparat vår gunstig metode, særlig for in vitro studier som krever store mengder av virus hvori høye doser av det samme viruset lager er nødvendig.
Introduction
Influensa A fortsetter å være en stor trussel mot menneskers helse. Det er en potensielt ødeleggende luftveissykdom med en stor global byrde forårsaker opp til 500.000 dødsfall på verdensbasis årlig en. Influensavirus er i familien Orthomyxoviridae og bære 8 negativ-sense enkelt-trådet RNA i deres genom 1,2. Den høye mutability (dvs. antigent "drift") av det virale genom forhindrer langvarig immunitet. Videre er influensa stadig motstandsdyktig mot antivirale legemidler tre.
2009 H1N1 influensa pandemi markert alle utfordrende problemstillinger knyttet til influensasykdom (pandemiske stammen, anti-virusresistens, forsinket vaksineproduksjon). Vaksinen formulering fastsettes årlig av Verdens helseorganisasjon for de mest sannsynlig patogene influensastammer (en hver for H1N1, H3N2 og influensa B) 4. Fordi denne metoden er basert på spådd influensaviruss, er patogene stammer tidvis feilaktig identifisert og vaksineeffekt synker dramatisk. Dessuten kan opptreden av nye influensastammer omgå disse forebyggende programmer som forårsaker sykdom epidemien 2.
Opprettelsen av en universell influensavaksine har vært unnvikende 5. Derfor må forskning fortsetter inn forstå patogenesen av lungeskade. Til anlegget laboratorieforskning, har flere metoder er utviklet for viral isolasjon og forplantning 6. Influ- ensavirus kan forsterkes i en rekke forskjellige pattedyrcelle substrater. Imidlertid genererer høy titer virus i store mengder best oppnås i embryonerte egg. Følgende protokoll beskriver en teknikk for influensa A-virus forplantning og lagring fra eksisterende virus aksjer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Influensa forårsaker en stor global sykdomsbyrde, og arbeidet fortsetter inn forstå patogenesen av lungeskade 7. Til rette for forskning i denne dødelige sykdommen har ulike metoder blitt utviklet for å forplante influensavirus 6. Her beskriver vi en teknikk for å frem influensavirus i kylling egg. Fordelen med denne metoden er at den er meget reproduserbar og resulterer i store mengder av høy titer influensavirus aksjer, som ofte er nødvendig for in vitro studier.
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was supported by the NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), and the American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | n/a | |
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol, >99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza — United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , (2006).
- Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
- Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
- Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).
