Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern
Summary
Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.
Abstract
Influenza-Infektion ist mit rund 36.000 Tote und mehr als 200.000 Krankenhauseinweisungen pro Jahr in den Vereinigten Staaten verbunden. Die kontinuierliche Entstehung neuer Influenza-Virus-Stämme aufgrund von Mutation und Wiederzusammenstellung erschwert die Kontrolle des Virus und die ständige Entwicklung neuer Arzneimittel und Impfstoffe. Die Laboruntersuchung von Influenza erfordert ein zuverlässiges und kostengünstiges Verfahren für die Vermehrung des Virus. Hier wird ein umfassendes Protokoll für Influenza-A-Virusvermehrung in fruchtbare Hühnereiern, die konsequent liefert hohen Titer Virusbeständen. 11 Tage – Kurz gesagt, werden Serum pathogenfreien (SPF) befruchtete Hühnereier bei 37 ° C und 55-60% Luftfeuchtigkeit für 10 inkubiert. In diesem Zeitraum können die Entwicklung des Embryos einfach mit ein Ei candler überwacht werden. Virusinokulation erfolgt durch Injektion von Virusstocks in die Allantois-Höhle unter Verwendung einer Nadel durchgeführt. Nach 2 Tagen Inkubation bei 37 ° C, sind die Eiergekühlt für mindestens 4 Stunden bei 4 ° C. Die Eischale oberhalb der Luftsack und die Chorioallantoismembran werden dann vorsichtig geöffnet und die Allantoisflüssigkeit, die das Virus geerntet. Das Fluid wird von Bruchstücken durch Zentrifugation geklärt, in Aliquote aufgeteilt und bis -80 ° C zur Langzeitlagerung transferiert. Die große Menge (5-10 ml des virushaltigen Fluids pro Ei) und hoher Virustiter in der Regel mit diesem Protokoll erreicht hat die Verwendung von Eiern für die Viruspräparation unserer günstiges Verfahren zur in vitro-Studien, die größere Mengen, insbesondere des Virus in denen hohe Dosierungen des gleichen Virusstock erforderlich.
Introduction
Influenza A weiterhin eine große Bedrohung für die menschliche Gesundheit sein. Es ist eine potenziell verheerenden Erkrankung der Atemwege mit einem großen globalen Belastung verursacht bis zu 500.000 Todesfälle weltweit pro Jahr 1. Influenza-Viren sind in der Familie Orthomyxoviridae und führen 8 Minus-Sense einzelsträngige RNA in ihrem Genom 1,2. Die hohe Veränderlichkeit (dh antigene "Drift") des Virusgenoms verhindert Langzeitimmunität. Außerdem ist Influenza zunehmend resistent gegen antivirale Medikamente 3.
Das H1N1 2009-Grippe-Pandemie markiert alle herausfordernden Fragen mit dem Influenzaerkrankung (Pandemie-Stamm, anti-virale Resistenz, verzögert Impfstoffproduktion) verbunden. Die Impfstoff-Formulierung wird jährlich von der Weltgesundheitsorganisation für die wahrscheinlichste pathogenen Influenza-Stämme (je eine für H1N1, H3N2 und Influenza B) 4 bestimmt. Da diese Methode beruht auf Annahmen basierte Influenza-Stamms, pathogenen Stämmen werden gelegentlich falsch identifiziert und die Wirksamkeit des Impfstoffes sinkt dramatisch. Darüber hinaus kann das Auftreten von neuen Influenza-Stämme diese präventive Programme verursachen Pandemien 2 zu umgehen.
Die Schaffung eines universellen Influenza-Impfstoff ist schwer 5. Daher müssen Erforschung Verständnis der Pathogenese der Lungenschädigung weiter. Um die Anlage der Laborforschung wurden verschiedene Verfahren für die virale Isolation und Vermehrung 6 entwickelt. Menschlichen Influenza-Viren können in einer Vielzahl von Säugetierzellsubstraten verstärkt werden. Jedoch werden die Erzeugung hoher Titer von Viren in großen Mengen am besten in embryonierten Eiern erreicht. Das folgende Protokoll beschreibt eine Technik für die Influenza A-Virusvermehrung und Speicherung von vorhandenen Virusstocks.
Protocol
Representative Results
Discussion
Influenza verursacht einen großen globalen Krankheitslast, und die Arbeit geht weiter in das Verständnis der Pathogenese der Lungenschädigung 7. Erleichtert die Forschung in dieser tödlichen Krankheit, wurden verschiedene Verfahren entwickelt, um den Influenzavirus 6 ausbreiten. Hier beschreiben wir eine Technik, um Influenza-Virus in Hühnereiern produziert. Der Vorteil dieses Verfahrens ist, dass es in hohem Maße reproduzierbar ist und führt zu großen Mengen von hohem Titer Influenzaviruss…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The present study was supported by the NIH grants HL120947 (P.C.), HL103868 (P.C.), and the American Heart Association Grant-in-Aid (P.C.)
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | |
| serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs | VALO BioMedia | n/a | |
| humidified egg incubator | FARM iNNOVATORS | Model 2100 | |
| automatic egg turner | FARM iNNOVATORS | Model 3200 | |
| egg candler | FARM iNNOVATORS | Model 3300 | |
| 1 ml syringe | BD Bioscience | 309659 | |
| 18G needle | BD Bioscience | 305196 | |
| 20G / 22G needle | BD Bioscience | 305176 / 305156 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Ethanol, >99.5% | Sigma-Aldrich | 459844 | diluted to 70% using water |
| glue gun "Ad tech Hi Temp Project Pro" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | Model 1105 | |
| glue "Ad tech MINI SIZE, Multi Temp" | Ad tech, Adhesive Technologies, Inc. | 220-34ZIP30 | |
| MDCK cells | ATCC | CRL-2935 | |
| Washed Pooled Turkey Red Blood Cells, 10% | Lampire Biological Laboratories | 724908 |
References
- Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Estimates of deaths associated with seasonal influenza — United States, 1976-2007. MMWR. Morbidity and mortality weekly report. 59 (33), 1057-1062 (2010).
- Neumann, G., Noda, T., Kawaoka, Y. Emergence and pandemic potential of swine-origin H1N1 influenza virus. Nature. 459 (7249), 931-939 (2009).
- Tumpey, T. M., Garcia-Sastre, A., et al. Pathogenicity of Influenza Viruses with Genes from the 1918 Pandemic Virus: Functional Roles of Alveolar Macrophages and Neutrophils in Limiting Virus Replication and Mortality in Mice. J Virol. 79 (23), 14933-14944 (2005).
- Doherty, P. C., Turner, S. J., Webby, R. G., Thomas, P. G. Influenza and the challenge for immunology. Nat Immu. 7 (5), 449-455 (2006).
- Webster, R. G., Govorkova, E. A. Continuing challenges in influenza. Ann N Y Acad Sci. 1323 (1), 115-139 (2014).
- Szretter, K. J., Balish, A. L., Katz, J. M. Unit 15G.1 Influenza: propagation, quantification, and storage. . Current protocols in microbiology. , (2006).
- Short, K. R., Kroeze, E. J. B. V., Fouchier, R. A. M., Kuiken, T. Pathogenesis of influenza-induced acute respiratory distress syndrome. Lancet Infect Dis. 14 (4), 57-69 (2014).
- Ito, T., Suzuki, Y., et al. Differences in sialic acid-galactose linkages in the chicken egg amnion and allantois influence human influenza virus receptor specificity and variant selection. J Virol. 71 (4), 3357-3362 (1997).
- Robertson, J. S., Nicolson, C., Major, D., Robertson, E. W., Wood, J. M. The role of amniotic passage in the egg-adaptation of human influenza virus is revealed by haemagglutinin sequence analyses. J Gen Virol. 74 (Pt 10), 2047-2051 (1993).
- Gaush, C. R., Smith, T. F. Replication and plaque assay of influenza virus in an established line of canine kidney cells). Appl Microbiol. 16 (4), 588-594 (1968).
