Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
calcineurin अवरोध करनेवाला Tacrolimus संयुक्त राज्य अमेरिका में ठोस अंग प्रत्यारोपण के बाद सबसे प्रतिरक्षादमनकारी उपचार प्रोटोकॉल की आधारशिला है। Tacrolimus एक संकीर्ण चिकित्सीय सूचकांक दवा है और के रूप में इस तरह के चिकित्सकीय दवा निगरानी और उसके पूरे रक्त गर्त सांद्रता पर आधारित खुराक समायोजन की आवश्यकता है। घर चिकित्सकीय दवा और पालन की निगरानी की सुविधा के लिए, सूखे खून के धब्बे के संग्रह के लिए एक आकर्षक अवधारणा है। एक उंगली छड़ी के बाद, रोगी घर पर फिल्टर पेपर पर एक बूंद खून एकत्र करता है। खून सूख गया है, के बाद यह Tacrolimus उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग मात्रा निर्धारित है जहां विश्लेषणात्मक प्रयोगशाला के लिए भेज दिया जाता है (एचपीएलसी-एमएस / एमएस) एक सरल मैनुअल प्रोटीन वर्षा कदम और ऑनलाइन स्तंभ निष्कर्षण के साथ संयोजन में।
Tacrolimus विश्लेषण के लिए, एक 6 मिमी डिस्क रक्त स्थान के संतृप्त केंद्र से मुक्का मारा है। रक्त जगह एक गोली ब्लेंडर एक का उपयोग कर homogenized हैएन डी तो प्रोटीन मेथनॉल / 0.2 एम ZnSO 4 आंतरिक मानक डी 2, 13 सी-Tacrolimus युक्त के साथ उपजी हैं। Vortexing और centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला के 100 μl एक ऑनलाइन निकासी कॉलम में इंजेक्ट किया जाता है और 5 मिलीग्राम / 0.1 फार्मिक एसिड / acetonitrile के मिनट के साथ धोया (7: 3, वी वी) के लिए 1 मिनट। इसके बाद, स्विचिंग वाल्व सक्रिय है और analytes विश्लेषणात्मक स्तंभ पर वापस-प्लावित (और एक 0.1% फार्मिक एसिड / acetonitrile ढाल का उपयोग कर अलग) कर रहे हैं। Tacrolimus मिलकर एक मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर सकारात्मक बहु प्रतिक्रिया मोड (एम आर एम) में मात्रा निर्धारित है।
परख 1 से 50 एनजी / एमएल से रैखिक है। के रूप में 20 दिनों से अधिक का मूल्यांकन इंटर-परख परिवर्तनशीलता (3.6% -6.1%) और सटीकता (91.7% -101.6%) स्वीकृति मानदंडों को पूरा। औसत निकासी वसूली 95.5% है। कैरी ओवर, मैट्रिक्स हस्तक्षेप और मैट्रिक्स प्रभाव कोई प्रासंगिक हैं। Tacrolimus आरटी पर और एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सूखे खून के धब्बे में स्थिर है। में निकाले नमूनेautosampler कम से कम 72 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रहे हैं।
Tacrolimus मैक्रोलाइड संरचना 8 (चित्रा 1) है कि एक शक्तिशाली immonosuppressant 1-7 है। 653 ग्राम / एल, इथेनॉल: – सीआईएस के कारण सीएन बांड की किन्नर संवयविता इसे उलट चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा अलग किया जा सकता है कि समाधान 9 में दो रोटामर रूपों (एचपीएलसी) Tacrolimus एल्कोहल (मेथनॉल में lipophilic और घुलनशील है 355 जी / एल), हाइड्रोकार्बन halogenated (क्लोरोफॉर्म: 573 ग्राम / एल) और आकाश। । 0.1 ग्राम / एल और पानी (पीएच: 3: यह स्निग्ध हाइड्रोकार्बन (हेक्सेन में संयम से घुलनशील है। अणु किसी क्रोमोफोर और उसके यूवी अवशोषण अधिकतम शामिल नहीं करता है 9 .0047 जी / एल) calcineurin के निषेध के माध्यम से 192 एनएम Tacrolimus कार्य करता है । कार्रवाई के अपने तंत्र संदर्भों 10,11 में समीक्षा की गई है। यह वर्तमान में संयुक्त राज्य अमेरिका के 12 में ठोस अंग प्रत्यारोपण के रोगियों के 80% से अधिक में प्रयोग किया जाता है।
Tacrolimus की चिकित्सीय सूचकांक considere हैD 13 संकीर्ण हो। इसके अलावा, Tacrolimus खुराक और रक्त सांद्रता के बीच संबंध खराब है और फार्माकोकाइनेटिक्स 14,15 चर रहा है। प्रत्यारोपण के रोगियों में Tacrolimus खुराक मार्गदर्शन करने के लिए चिकित्सीय दवा निगरानी इसलिए सामान्य नैदानिक अभ्यास 16-20 है। लक्ष्य के लिए एक पूर्व निर्धारित चिकित्सकीय सीमा के भीतर Tacrolimus रक्त सांद्रता रखने के लिए है। चिकित्सकीय खिड़की के ऊपर सांद्रता अधिक-प्रतिरक्षादमन, कैंसर और ऐसे नेफ्रोटोक्सिटी, न्यूरोटॉक्सिटी, उच्च रक्तचाप और मधुमेह के रूप में विषाक्तता, के लिए खतरा बढ़ जबकि चिकित्सकीय रेंज नीचे Tacrolimus रक्त सांद्रता, क्रोनिक या तीव्र Allo प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं की वृद्धि की गतिविधि में परिणाम हो सकता है। Tacrolimus की उच्च फ़ार्माकोकायनेटिक इंट्रा-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता प्रत्यारोपण अंग है और मरीज को अस्तित्व 21,22 दोनों के लिए हानिकारक हो सकता है। Tacrolimus फार्माकोकाइनेटिक्स की अंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलता मुख्य रूप से CYP3A5 बहुरूपताओं, इंट्रा-व्यक्ति के लिए कारणों की वजह से है, जबकिपरिवर्तनशीलता शामिल हैं, लेकिन दवा दवा, रोग-दवा और भोजन-दवा बातचीत 14,15 तक सीमित नहीं हैं। इसके अलावा प्रतिरक्षादमनकारी चिकित्सकीय दवा आहार के पालन के अभाव में एक योगदान कारक और भ्रष्टाचार नुकसान 23,24 के लिए एक प्रमुख कारण है।
इन कारणों से अक्सर घर चिकित्सकीय दवा और Tacrolimus पूरे रक्त सांद्रता का पालन निगरानी रोगियों को हर समय वांछित चिकित्सकीय खिड़की के भीतर Tacrolimus जोखिम है कि यह सुनिश्चित करने के लिए फायदेमंद हो सकता है कि सुझाव। हालांकि, यह वर्तमान नैदानिक अभ्यास 15 निषेधात्मक है रसद और अधिक लगातार चिकित्सकीय दवा निगरानी की लागत के रूप में है। कारणों में से एक मरीज को एक phlebotomist खींचा आवश्यक शिरापरक रक्त नमूना है यह देखने के लिए किया है। सूखे खून के धब्बे हाल ही में एक आकर्षक अवधारणा 25-28 के रूप में उभरा है। रोगी छड़ी एक सरल उंगली के बाद एक विशेष फिल्टर पेपर कार्ड पर और रक्त मौके घ है के बाद एक बूंद खून एकत्र करता हैRied, यह Tacrolimus के विश्लेषण और मरीज वर्तमान में ले जा सकता है कि किसी भी अन्य प्रतिरक्षादमनकारी के लिए एक केंद्रीय प्रयोगशाला में भेजा जा सकता है। इस तरह के सूखे खून के धब्बे (खून की आम तौर पर 20 μl) 25,29-43 के रूप में होने के कारण बहुत छोटी रक्त की मात्रा में Tacrolimus और अन्य immunosuppressants की मात्रा का ठहराव के लिए अत्यधिक संवेदनशील और विशिष्ट नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस assays के विकास के लिए संभव हो गया है। एक और लाभ यह इस तरह के सूखे खून के धब्बे के रूप में न्यूनतम इनवेसिव, कम मात्रा नमूना संग्रह रणनीतियों बहुत छोटे बच्चों के 28 में चिकित्सकीय दवा निगरानी और फ़ार्माकोकायनेटिक अध्ययन की सुविधा है।
Tacrolimus आमतौर पर शिरापरक EDTA पूरे रक्त 15 में मापा जाता है। कारण Tacrolimus बड़े पैमाने पर रक्त कोशिकाओं में वितरित करता है कि और नैदानिक अध्ययन नैदानिक घटनाओं 15,18 के साथ तुलना में प्लाज्मा रक्त में Tacrolimus गर्त सांद्रता के बीच बेहतर सहसंबंध को सूचित किया है कि कर रहे हैं। इसकी तुलना में, टा का विश्लेषणसूखे खून के धब्बे में crolimus फिल्टर पेपर मैट्रिक्स के साथ मिलाया जाता है कि केशिका रक्त पर आधारित है। यह नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस विश्लेषण के साथ Tacrolimus और संभावित हस्तक्षेप के solubilization के संदर्भ में चुनौतियों प्रस्तुत करता है। यहाँ हम एक उच्च प्रवाह ऑनलाइन स्तंभ नमूना को साफ प्रक्रिया और नियंत्रण रेखा-एमएस / एमएस विश्लेषण के साथ संयोजन में एक गोली ब्लेंडर का उपयोग कर सूखे रक्त स्थान के homogenization के आधार पर एक स्थापित और मान्य परख प्रस्तुत करते हैं। आज के रूप में, इस परख सफलतापूर्वक क्लिनिकल परीक्षण में पालन की निगरानी के लिए पांच हजार से अधिक Tacrolimus सूखे रक्त मौके नमूनों की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया गया है।
ऊपर उल्लिखित के रूप में, सूखे खून के धब्बे के आधार पर चिकित्सकीय दवा और Tacrolimus का पालन निगरानी की अवधारणा को आकर्षक है, हालांकि, आम तौर पर शिरापरक EDTA पूरे रक्त के नमूनों में Tacrolimus की नियंत्रण रेखा एमएस / एमएस व?…
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.
Reference Materials | ||
Tacrolimus | U.S. Pharmacopeial Convention | 1642802 |
D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | F370002 |
Test Materials | ||
Red blood cells | University of Colorado Hospital | W20091305500 V |
Plasma | University of Colorado Hospital | W2017130556300Q |
Solvents | ||
Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥ 99,9 % | Sigma-Aldrich | 439126-4 L |
Acetonitrile Optima LC/ MS, UHPLC- UV | Thermo Fisher Scientific | A955-4 |
Isopropanol 99.9 %, HPLC | Fisher Scientific | BP2632-4 |
Methanol Optima LC/ MS | Thermo Fisher Scientific | A452-4 |
Water Optima LC/ MS, UHPLC- UV | Thermo Fisher Scientific | W6-4 |
Other Chemicals | ||
Formic acid | Thermo Fisher Scientific | A118P-500 |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 |
Zinc sulfate | Thermo Fisher Scientific | Z68-500 |
Laboratory Instruments and Consumables | ||
0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008649 |
1,5 mL- Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-682-550 |
10 – 100 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008651 |
10 μL- pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 10XLS3 |
100 – 1000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008653 |
100 μL- pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 100 |
1000 μL- pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2940 |
2 – 20 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008650 |
2 mL- Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-681-258 |
20 – 200 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008652 |
20 μL- pipet tips with filter, sterile | GeneMate | P-1237-20 |
200 μL- pipet tips with filter | Multimax | 2938T |
200 μL- pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2936J |
50 mL- Falcon tube | BD Falcon | 352070 |
300 μL inserts for HPLC vials | Phenomenex | ARO-9973-13 |
Balance PR2002 | Mettler Toledo | 1117050723 |
Balances AX205 Delta Range | Mettler Toledo | 1119343379 |
Bullet Blender Homogenizer | Next Advance | BBX24 |
Centrifuge Biofuge Fresco | Heraeus | 290395 |
Disposable Wipes | PDI | Q55172 |
Glass v ials, 4 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-955-334 |
Glass vials, 20 mL | Thermo Fisher Scientific | B7800-20 |
Gloves, nitrile | Titan Brand Gloves | 44-100S |
HPLC vials, 9 mm, 2 mL, clear | Phenomenex | ARO- 9921-13 |
Lids for HPLC vials | Phenomenex | ARO- 8952-13-B |
Needle, 18G 1.5 | Precision Glide | 305196 |
Rack for Eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 03-448-11 |
Rack for HPLC Vials | Thermo Fisher Scientific | 05-541-29 |
Steel beads 0.9 – 2 mm | Next Advance | SSB14B |
Storage boxes for freezers / refrigerators | Thermo Fisher Scientific | 03-395-464 |
Standard multi-tube vortexer | VWR Scientific Products | 658816-115 |
Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK | GE Whatman | 2016-05 |
HPLC Equipment and Columns | ||
Autosampler | CTC PAL | PAL.HTCABIx1 |
Binary pump, Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B |
Binary pump, Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A |
Micro vacuum degasser, Agilent 1260 | Agilent Technologies | 1260 G13798 |
Column oven, Agilent 1290 with 2 position | Agilent Technologies | 1290 G1216C |
Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve | Agilent Technologies | 1290 G1316C |
HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm | Phenomenex | 820950-926 |
HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm | Phenomenex | 993967-906 |
Tandem Mass Spectrometer | ||
API5000 MS/MS with TurboIonspray source | AB Sciex | 4364257 |
Mass spectrometry software | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |