כימות של Tacrolimus לדיכוי מערכת החיסון בכתמי דם יבש באמצעות LC-MS / MS
Summary
Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
Abstract
Tacrolimus מעכב calcineurin הוא אבן הפינה של רוב פרוטוקולי טיפול מדכא חיסון לאחר השתלת איברים מוצקה בארצות הברית. Tacrolimus הוא תרופת מדד טיפולית צרה וכגון דורש ניטור תרופה טיפולי והתאמת מינון המבוסס על ריכוזי שוקת דם כולה. כדי להקל על תרופה טיפולית בית וניטור דבקות, האוסף של כתמי דם יבשים הוא מושג אטרקטיבי. אחרי אצבע מקל, המטופל אוסף טיפת דם על נייר סינון בבית. אחרי הדם מיובש, הוא ישלח למעבדה אנליטית שבי tacrolimus הוא לכמת באמצעות ספקטרומטר מסת כרומטוגרפיה הנוזלי-טנדם ביצועים גבוהים (HPLC-MS / MS) בשילוב עם צעד פשוט מדריך למשקעי חלבון ומיצוי טור מקוון.
לניתוח tacrolimus, דיסק 6 מ"מ אגרוף מהמרכז הרווי של נקודת הדם. נקודת הדם הומוגני באמצעות בלנדר כדורND אז חלבונים הם זירז עם מתנול / 0.2 M 4 ZnSO מכיל הסטנדרטי D הפנימי 2, 13 C-tacrolimus. לאחר vortexing וצנטריפוגה, של supernatant 100 μl מוזרק לתוך עמודת חילוץ מקוונת ונשטפה עם 5 מיליליטר / דקה של 0.1 חומצה / אצטוניטריל פורמית (7: 3, v: v) עבור 1 דקות. מכאן והלאה, שסתום המיתוג מופעל וanalytes-סמוק בחזרה על טור אנליטי (ומופרד באמצעות 0.1% שיפוע חומצה / אצטוניטריל פורמית). Tacrolimus הוא לכמת במצב החיובי רב התגובה (MRM) באמצעות ספקטרומטר מסת טנדם.
Assay הוא ליניארי 1-50 ng / ml. שונות הבין-assay (3.6% -6.1%) ודיוק (91.7% -101.6%) כפי שהוערכו על 20 ימים עומדים בקריטריוני קבלה. התאוששות החילוץ הממוצעת היא 95.5%. אין לשאת על, הפרעות מטריצה ואפקטי מטריצה רלוונטיות. Tacrolimus הוא יציב בכתמי דם יבשים ב RT ובמעלות צלזיוס +4 לשבוע 1. דגימות שחולצו בautosampler יציבה במעלות צלזיוס +4 לפחות 72 שעות.
Introduction
Tacrolimus הוא immonosuppressant חזק 1-7 שיש לו מבנה macrolide 8 (איור 1). בשל חבר העמים – איזומרים טרנס של אגרות חוב CN הוא יוצר שתי rotamers בפתרון 9 שיכולים להיות מופרד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים שלב הפוך (HPLC) Tacrolimus הוא lipophilic ומסיס באלכוהול (מתנול: 653 גר '/ ל', אתנול: 355 g / L), פחמימנים הלוגנים (כלורופורם: 573 גר '/ ל') ואתר. זה במשורה מסיס בפחמימנים אליפטי (הקסאן: 0.1 גר '/ L ומים (pH 3:. .0047 G / L) 9 המולקולה אינה מכילה chromophore ומקסימום UV-הקליטה שלו הוא 192 ננומטר מעשי Tacrolimus באמצעות עיכוב של calcineurin. . מנגנון פעולתה נבדק באזכור 10,11. הוא משמש כיום בלמעלה מ -80% ממושתלי איברים מוצקים בארצות הברית 12.
המדד הטיפולי של tacrolimus הוא considereד להיות צר 13. בנוסף, הקשר בין מינוני tacrolimus וריכוזי דם הוא עני והפרמקוקינטיקה משתנה 14,15. ניטור תרופה טיפולי להנחות מינון tacrolimus במושתלים הוא פרקטיקה קלינית ולכן כללית 16-20. המטרה היא לשמור על ריכוזי דם tacrolimus בטווח טיפולי מוגדר מראש. ריכוזי דם tacrolimus מתחת לטווח הטיפולי עלולים לגרום לפעילות מוגברת של תגובות allo-חיסוני כרוניות או אקוטיות, בעוד ריכוזים מעל החלון הטיפולי להגביר את הסיכון לסרטן ורעילות, כגון Nephrotoxicity, רעילויות, יתר לחץ דם, סוכרת ועל-דיכוי חיסוני. שונות התוך-אישיות pharmacokinetic גבוהות של tacrolimus עלולות לפגוע בשני איברים להשתלה והישרדות חולה 21,22. בעוד שונות הבין-אישיות של הפרמקוקינטיקה tacrolimus נגרמות בעיקר על ידי פולימורפיזם CYP3A5, סיבות לתוך אישיהשתנות כוללות, אך אינם מוגבלות ליחסי גומלין, תרופתיות, מחלות-סמים ומזון תרופתיים 14,15. גם חוסר הדבקות במשטר התרופה לדיכוי מערכת החיסון הטיפולי הוא גורם תורם וסיבה עיקרית לאובדן 23,24 שתל.
שיקולים אלה מצביעים על כך שתרופה טיפולית הבית תכוף וניטור דבקות של ריכוזי דם כל tacrolimus עשויה להיות מועילות כדי להבטיח שיש לי חולים חשיפת tacrolimus בתוך החלון הטיפולי הרצוי בכל העת. עם זאת, הלוגיסטיקה ועלות ניטור תרופה טיפולית תכוף יותר כפי שהוא פרקטיקה קלינית נוכחית 15 היא מונע. אחת הסיבות הוא שהחולה צריך לראות phlebotomist יש דגימת דם ורידים הנדרשת נמשכת. כתמי דם יבשים צמחו לאחרונה כקונספט אטרקטיבי 25-28. אחרי אצבע פשוטה מקל החולה אוסף טיפת דם על כרטיס נייר סינון מיוחד ולאחר נקודת דם דRied, זה יכול להיות בדואר למעבדה מרכזית לניתוח של tacrolimus וכל החיסון אחר שהמטופל יכול כרגע לקחת. זה הפך להיות אפשרי בשל הפיתוח של מבחני LC-MS / MS רגישים והספציפיים ביותר עבור כימות של tacrolimus ומערכת חיסון אחר בכמויות דם קטנות מאוד כגון כתמי דם יבשים (בדרך כלל 20 μl דם) 25,29-43. יתרון נוסף הוא שנפח דגימת אסטרטגיות פולשנית, נמוכות אוסף כגון כתמי דם יבשים להקל ניטור טיפולי סמים ומחקרי פרמקוקינטיקה בילדים קטנים מאוד 28.
Tacrolimus נמדד בדרך כלל בכל דם ורידי EDTA 15. סיבות לכך הן שtacrolimus מפיץ בהרחבה לתאי דם וכי מחקרים קליניים דיווחו מתאם טוב יותר בין ריכוזי שוקת tacrolimus בדם מאשר בפלזמה עם אירועים קליניים 15,18. לשם השוואה, הניתוח של ת"אcrolimus בכתמי דם יבש מבוסס על דם נימים כי הוא מעורבב עם מטריצת נייר סינון. זה מציב אתגרים במונחים של solubilization של tacrolimus והפרעות פוטנציאליות עם ניתוח LC-MS / MS. כאן אנו מציגים assay הוקם ומאומתים על בסיס הומוגניזציה של נקודת הדם היבש באמצעות בלנדר כדור בשילוב עם מדגם גבוהה זרימת טור מקוון הליך לנקות וניתוח LC-MS / MS. נכון להיום, assay זה בהצלחה משמש לכימות של יותר מחמישה אלף דגימות דם נקודת tacrolimus מיובשות לניטור דבקות בניסויים קליניים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אמנם, כאמור, את הרעיון של תרופה טיפולית ומעקב דבקות של tacrolimus מבוסס על כתמי דם יבשים הוא אטרקטיבי, יש אתגרים אנליטיים שהולכים מעבר לאלו שבדרך כלל קשורים לניתוח LC-MS / MS של tacrolimus בדגימות דם כל EDTA ורידים. אלה כוללים, אך לא רק, את העובדה שהמטריצה היא כל נימי הדם נספג חומר lin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.
Materials
| Reference Materials | ||
| Tacrolimus | U.S. Pharmacopeial Convention | 1642802 |
| D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | F370002 |
| Test Materials | ||
| Red blood cells | University of Colorado Hospital | W20091305500 V |
| Plasma | University of Colorado Hospital | W2017130556300Q |
| Solvents | ||
| Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥ 99,9 % | Sigma-Aldrich | 439126-4 L |
| Acetonitrile Optima LC/ MS, UHPLC- UV | Thermo Fisher Scientific | A955-4 |
| Isopropanol 99.9 %, HPLC | Fisher Scientific | BP2632-4 |
| Methanol Optima LC/ MS | Thermo Fisher Scientific | A452-4 |
| Water Optima LC/ MS, UHPLC- UV | Thermo Fisher Scientific | W6-4 |
| Other Chemicals | ||
| Formic acid | Thermo Fisher Scientific | A118P-500 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 |
| Zinc sulfate | Thermo Fisher Scientific | Z68-500 |
| Laboratory Instruments and Consumables | ||
| 0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008649 |
| 1,5 mL- Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-682-550 |
| 10 – 100 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008651 |
| 10 μL- pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 10XLS3 |
| 100 – 1000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008653 |
| 100 μL- pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 100 |
| 1000 μL- pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2940 |
| 2 – 20 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008650 |
| 2 mL- Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-681-258 |
| 20 – 200 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008652 |
| 20 μL- pipet tips with filter, sterile | GeneMate | P-1237-20 |
| 200 μL- pipet tips with filter | Multimax | 2938T |
| 200 μL- pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2936J |
| 50 mL- Falcon tube | BD Falcon | 352070 |
| 300 μL inserts for HPLC vials | Phenomenex | ARO-9973-13 |
| Balance PR2002 | Mettler Toledo | 1117050723 |
| Balances AX205 Delta Range | Mettler Toledo | 1119343379 |
| Bullet Blender Homogenizer | Next Advance | BBX24 |
| Centrifuge Biofuge Fresco | Heraeus | 290395 |
| Disposable Wipes | PDI | Q55172 |
| Glass v ials, 4 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-955-334 |
| Glass vials, 20 mL | Thermo Fisher Scientific | B7800-20 |
| Gloves, nitrile | Titan Brand Gloves | 44-100S |
| HPLC vials, 9 mm, 2 mL, clear | Phenomenex | ARO- 9921-13 |
| Lids for HPLC vials | Phenomenex | ARO- 8952-13-B |
| Needle, 18G 1.5 | Precision Glide | 305196 |
| Rack for Eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 03-448-11 |
| Rack for HPLC Vials | Thermo Fisher Scientific | 05-541-29 |
| Steel beads 0.9 – 2 mm | Next Advance | SSB14B |
| Storage boxes for freezers / refrigerators | Thermo Fisher Scientific | 03-395-464 |
| Standard multi-tube vortexer | VWR Scientific Products | 658816-115 |
| Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK | GE Whatman | 2016-05 |
| HPLC Equipment and Columns | ||
| Autosampler | CTC PAL | PAL.HTCABIx1 |
| Binary pump, Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B |
| Binary pump, Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A |
| Micro vacuum degasser, Agilent 1260 | Agilent Technologies | 1260 G13798 |
| Column oven, Agilent 1290 with 2 position | Agilent Technologies | 1290 G1216C |
| Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve | Agilent Technologies | 1290 G1316C |
| HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm | Phenomenex | 820950-926 |
| HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm | Phenomenex | 993967-906 |
| Tandem Mass Spectrometer | ||
| API5000 MS/MS with TurboIonspray source | AB Sciex | 4364257 |
| Mass spectrometry software | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |
References
- Goto, T., et al. Discovery of FK506, a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 19 (5 Suppl 6), 4-8 (1987).
- Kino, T., Hatanaka, H., Miyata, S. FK506, a novel immunosuppressant isolated from a streptomyces. I: Fermentation, isolation and physico-chemical and biological characteristics. J. Antibiotics. 40 (9), 1249-1255 (1987).
- Starzl, T. E., et al. FK506 for liver, kidney and pancreas transplantation. Lancet. 2 (8670), 1000-1004 (1989).
- . Randomised trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporin in prevention of liver allograft rejection. European FK506 Multicentre Liver Study Group. Lancet. 344 (8920), 423-428 (1994).
- . A comparison of tacrolimus (FK 506) and cyclosporine for immunosuppression in liver transplantation. The U.S. Multicenter FK506 Liver Study Group. N. Engl. J. Med. 331 (17), 1110-1115 (1994).
- Mayer, A. D., et al. Multicenter randomized trial comparing tacrolimus (FK506) and cyclosporine in the prevention of renal allograft rejection: a report of the European Tacrolimus Multicenter Renal Study Group. Transplantation. 64 (3), 436-443 (1997).
- Pirsch, J. D., Miller, J., Deierhoi, M. H., Vincenti, F., Filo, R. S. A comparison of tacrolimus (FK506) and cyclosporine for immunosuppression after cadaveric renal transplantation. FK506 Kidney Transplant Study Group.. Transplantation. 15 (7), 977-983 (1997).
- Tanaka, H., et al. Physicochemical properties of FK506 a novel immunosuppressant isolated from Streptomyces Tsukubaensis. Transplant Proc. 14 ((5 Suppl 6)), 11-16 (1987).
- Spencer, C. M., Goa, K. L., Gills, J. C. Tacrolimus. An update of its pharmacology and clinical efficacy in the management of organ transplantation. Drugs. 54 (6), 925-975 (1997).
- Clipstone, N. A., Crabtree, G. R. Identification of calcineurin as a key signalling enzyme in T-lymphocyte activation. Nature. 357 (6380), 695-697 (1992).
- Barbarino, J. M., Staatz, C. E., Venkataramanan, R., Klein, T. E., Altman, R. B. PharmGKB summary: cyclosporine and tacrolimus pathways. Pharmacogenet. Genomics. 23 (10), 563-585 (2013).
- Christians, U., Benet, L. Z., Lampen, A. Mechanisms of clinically significant drug interactions associated with tacrolimus. Clin. Pharmacokinet. 41 (11), 813-851 (2002).
- Christians, U., Pokaiyavananichkul, T., Chan, L., Burton, M. E., Shaw, L. M., Schentag, J. J., Evans, W. e. b. b. Tacrolimus In: Pharmacokinetics and Pharmacodynamics. Principles of Therapeutic Drug Monitoring. , 529-562 (2005).
- Holt, D. W., et al. International Federation of Clinical Chemistry/ International Association of Therapeutic Drug Monitoring and Clinical Toxicology working group on immunosuppressive drug monitoring. Ther. Drug Monit. 24 (1), 59-67 (2002).
- Holt, D. W., Jones, K., Lee, T., Stadler, P., Johnston, A. Quality assessment issues of new immunosuppressive drugs and experimental experience. Ther. Drug Monit. 18 (4), 362-367 (1996).
- Jusko, W. J., et al. Consensus document: therapeutic drug monitoring of tacrolimus (FK-506). Ther. Drug Monit. 17 (6), 606-614 (1995).
- Oellerich, M., et al. Therapeutic drug monitoring of cyclosporine and tacrolimus. Update on Lake Louise Conference on cyclosporine and tacrolimus. Clin. Biochem. 31 (5), 309-316 (1998).
- Wong, S. H. Therapeutic drug monitoring for immunosuppressants. Clin. Chim. Acta. 313 (1-2), 241-253 (2001).
- Kahan, B. D., et al. Low intraindividual variability of cyclosporin A exposure reduces chronic rejection incidence and health care costs. J. Am. Soc. Nephrol. 11 (6), 1122-1131 (2000).
- Kahan, B. D., et al. Variable oral absorption of cyclosporine. A biopharmaceutical risk factor for chronic renal allograft rejection. Transplantation. 62 (5), 599-606 (1996).
- Kelly, D. A. Current issues in pediatric transplantation. Pediatr. Transplant. 10 (6), 712-720 (2006).
- Spivey, C. A., Chisholm-Burns, M. A., Damadzadeh, B., Billheimer, D. Determining the effect of immunosuppressant adherence on graft failure risk among renal transplant recipients. Clin. Transplant. 28 (1), 96-104 (2014).
- Taylor, P. J., Tai, C. H., Franklin, M. E., Pillans, P. I. The current role of liquid chromatography-tandem mass spectrometry in therapeutic drug monitoring of immunosuppressant and antiretroviral drugs. Clin. Biochem. 44 (1), 14-20 (2011).
- Edelbroek, P. M., van der Heijden, J., Stolk, L. M. Dried blood spot methods in therapeutic drug monitoring: methods, assays, and pitfalls. Ther. Drug Monit. 31 (3), 327-336 (2009).
- Meesters, R. J., Hooff, G. P. State-of-the-art dried blood spot analysis: an overview of recent advances and future trends. Bioanalysis. 5 (17), 2187-2208 (2013).
- Pandya, H. C., Spooner, N., Mulla, H. Dried blood spots, pharmacokinetic studies and better medicines for children. Bioanalysis. 3 (7), 779-786 (2011).
- Koster, R. A., Alffenaar, J. W., Greijdanus, B., Uges, D. R. Fast LC-MS/MS analysis of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporin A in dried blood spots and the influence of the hematocrit and immunosuppressant concentration on recovery. Talanta. 115 (Oct 15), 47-54 (2013).
- Hinchliffe, E., Adaway, J., Fildes, J., Rowan, A., Keevil, B. G. Therapeutic drug monitoring of ciclosporin A and tacrolimus in heart lung transplant patients using dried blood spots. Ann Clin. Biochem. 51 (Pt 1), 106-109 (2014).
- Koop, D. R., Bleyle, L. A., Munar, M., Cherala, G., Al-Uzri, A. Analysis of tacrolimus and creatinine from a single dried blood spot using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 926 ((May 1)), 54-61 (2013).
- Sadilkova, K., Busby, B., Dickerson, J. A., Rutledge, J. C., Jack, R. M. Clinical validation and implementation of a multiplexed immunosuppressant assay in dried blood spots by LC-MS/MS. Clin. Chim. Acta.. 421 ((Jun 5)), 152-156 (2013).
- Li, Q., Cao, D., Huang, Y., Xu, H., Yu, C., Li, Z. Development and validation of a sensitive LC-MS/MS method for determination of tacrolimus on dried blood spots. Biomed. Chromatogr. 27 (3), 327-334 (2013).
- Hinchliffe, E., Adaway, J. E., Keevil, B. G. Simultaneous measurement of cyclosporin A and tacrolimus from dried blood spots by ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci.. 883-884 ((Feb 1)), 102-107 (2012).
- Webb, N. J., Roberts, D., Preziosi, R., Keevil, B. G. Fingerprick blood samples can be used to accurately measure tacrolimus levels by tandem mass spectrometry). Pediatr. Transplant. 9 (6), 729-733 (2005).
- Keevil, B. G., Fildes, J., Baynes, A., Yonan, N. Liquid chromatography-mass spectrometry measurement of tacrolimus in finger-prick samples compared with venous whole blood samples. Ann. Clin. Biochem. 46 (Pt 2), 144-145 (2009).
- Yonan, N., Martyszczuk, R., Machaal, A., Baynes, A., Keevil, B. G. Monitoring of cyclosporine levels in transplant recipients using self-administered fingerprick sampling. Clin. Transpl. 20 (2), 221-225 (2006).
- Keevil, B. G., et al. Simultaneous and rapid analysis of cyclosporin A and creatinine in finger prick blood samples using liquid chromatography tandem mass spectrometry and its application in C2 monitoring. Ther Drug Monit. 24 (6), 757-767 (2002).
- Hoogtanders, K., et al. Dried blood spot measurement of tacrolimus is promising for patient monitoring. Transplantation. 83 (2), 237-238 (2007).
- Heijden, J., et al. Therapeutic drug monitoring of everolimus using the dried blood spot method in combination with liquid chromatography-mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 50 (4), 664-670 (2009).
- Cheung, C. Y., et al. Dried blood spot measurement: application in tacrolimus monitoring using limited sampling strategy and abbreviated AUC estimation. Transpl. Int. 21 (2), 140-145 (2008).
- Hoogtanders, K., et al. Therapeutic drug monitoring of tacrolimus with the dried blood spot method. J. Pharm. Biomed. Anal. 44 (3), 658-664 (2007).
- Wilhelm, A. J., den Burger, C. J., Vos, R. M., Chahbouni, A., Sinjewel, A. Analysis of cyclosporin A in dried blood spots using liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (14-15), 1595-1598 (2009).
- Ostler, M. W., Porter, J. H., Buxton, M. O. Dried blood spot collection of health biomarkers to maximize participation in population studies. J. Vis. Exp. (83), e50973 (2014).
- Schäfer, P., Störtzel, M., Vogt, S., Weinmann, W. Ion suppression effects in liquid chromatography-electrospray-ionisation transport-region collision induced dissociation mass spectrometry with different serum extraction methods for systematic toxicological analysis with mass spectra libraries. J. Chromatogr. B. 773 (1), 47-52 (2002).
- Peck, H. R., Timko, D. M., Landmark, J. D., Stickle, D. F. A survey of apparent blood volumes and sample geometries among filter paper bloodspot samples submitted for lead screening. Clin. Chim. Acta. 400 (1-2), 103-106 (2009).
- Christians, U., et al. Automated, fast and sensitive quantification of drugs in blood by liquid chromatography-mass spectrometry with on-line extraction: immunosuppressants. J. Chromatogr. B. 748 (1), 41-53 (2000).
- Clavijo, C., et al. Development and validation of a semi-automated assay for the highly sensitive quantification of Biolimus A9 in human whole blood using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 877 (29), 3506-3514 (2009).
- Mei, J. V., Alexander, J. R., Adam, B. W., Hannon, W. H. Use of filter paper for the collection and analysis of human whole blood specimens. J. Nutr. 131 (5), S1631-S1636 (2001).
