Quantification de l'immunosuppresseur tacrolimus sur des taches de sang séché en utilisant LC-MS / MS
Summary
Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.
Abstract
Le tacrolimus inhibiteur de la calcineurine est la pierre angulaire de la plupart des protocoles de traitement immunosuppresseur après une transplantation d'organe solide aux États-Unis. Tacrolimus est un médicament étroite indice thérapeutique et en tant que telle exige suivi thérapeutique et ajustement de la dose en fonction de l'ensemble de son concentrations résiduelles dans le sang. Pour faciliter la maison médicament thérapeutique et le suivi de l'adhésion, la collecte des taches de sang séché est un concept attrayant. Après un bâton de doigt, le patient perçoit une goutte de sang sur un papier filtre à la maison. Après que le sang est séché, il est envoyé au laboratoire d'analyse où le tacrolimus est quantifiée par liquide à haute performance chromatographie-spectrométrie de masse tandem (HPLC-MS / MS) en combinaison avec une étape protéines de précipitation manuel simple et l'extraction de la colonne en ligne.
Pour l'analyse de tacrolimus, un disque de 6 mm est poinçonnée du centre saturée de la tache de sang. La tache de sang est homogénéisé à l'aide d'une balle d'un mélangeure puis protéines sont précipitées avec du méthanol / 0,2 M ZnSO 4 contenant le standard interne D 2, 13 C-tacrolimus. Après agitation au vortex et centrifugation, 100 ul de surnageant sont injectés dans une colonne d'extraction en ligne et on les lave avec 5 ml / min de 0,1 acide formique / acétonitrile (7: 3, v: v) pendant 1 min. Ci-après, la soupape de commutation est activé et les analytes sont contre-rinçage sur la colonne analytique (et séparé en utilisant un gradient d'acide formique / acétonitrile 0,1%). Le tacrolimus est quantifiée en mode positif de réaction multiples (MRM) en utilisant un spectromètre de masse en tandem.
Le dosage est linéaire de 1 à 50 ng / ml. La variabilité inter-essai (3,6% -6,1%) et la précision (91,7% -101,6%) selon l'évaluation de plus de 20 jours répondent aux critères d'acceptation. Récupération d'extraction moyenne est de 95,5%. Il n'y a pas de report, les interférences de matrice et les effets de matrice pertinente. Tacrolimus est stable dans des taches de sang séchées à température ambiante et à 4 ° C pendant 1 semaine. Les échantillons extraits dans leéchantillonneur automatique sont stables à 4 ° C pendant au moins 72 heures.
Introduction
Le tacrolimus est un puissant immonosuppressant 1-7 qui a une structure de macrolide 8 (figure 1). En raison de cis – isomérie trans des liaisons CN il forme deux rotamères en solution 9 qui peuvent être séparés par chromatographie en phase liquide à haute performance en phase inverse (HPLC) Tacrolimus est lipophile et soluble dans les alcools (methanol: 653 g / L, de l'éthanol: 355 g / L), des hydrocarbures halogènes (chloroforme: 573 g / L) et de l'éther. Il est peu soluble dans les hydrocarbures aliphatiques (hexane: 0,1 g / L et de l'eau (pH 3:. 0,0047 g / L) 9 La molécule ne contient pas de chromophore et son maximum d'absorption UV est de 192 nm tacrolimus agit par l'intermédiaire inhibition de la calcineurine. . Son mécanisme d'action a été examiné dans les références 10,11. Il est actuellement utilisé dans plus de 80% des patients transplantés organes solides aux Etats-Unis 12.
L'indice thérapeutique du tacrolimus est considered soit 13 étroite. En outre, la corrélation entre les doses de tacrolimus et les concentrations sanguines est pauvre et la pharmacocinétique est variable 14,15. Suivi des concentrations thérapeutiques pour guider tacrolimus dosage chez les patients transplantés est donc pratique clinique générale 16-20. L'objectif est de maintenir les concentrations sanguines de tacrolimus dans une plage thérapeutique pré-défini. Les concentrations sanguines de tacrolimus en dessous de la gamme thérapeutique peut entraîner une augmentation de l'activité des réactions d'allo-immunes chroniques ou aiguës, tandis que des concentrations supérieures à la fenêtre thérapeutique augmentent le risque de sur-immunosuppression, le cancer et la toxicité, tels que la néphrotoxicité, la neurotoxicité, l'hypertension et le diabète. Haute pharmacocinétique variabilité intra-individuelle de tacrolimus peut être préjudiciable à la fois organe de greffe et de la survie des patients 21,22. Bien variabilité inter-individuelle de la pharmacocinétique du tacrolimus est principalement causée par des polymorphismes de CYP3A5, pour des raisons intra-individuellela variabilité comprennent, mais ne sont pas limités à des interactions médicament-médicament, la maladie-médicaments et de la nourriture-médicaments 14,15. Aussi le manque d'adhésion à la thérapeutique régime de médicament immunosuppresseur est un facteur et une raison majeure de perte du greffon 23,24.
Ces considérations suggèrent que la maison fréquente médicament thérapeutique et le suivi de l'observance des concentrations de tacrolimus sur sang total peut être bénéfique pour assurer que les patients ont une exposition de tacrolimus dans la fenêtre thérapeutique souhaité en tout temps. Cependant, la logistique et le coût de la surveillance plus fréquente de drogue thérapeutique comme il est de pratique clinique actuelle 15 est prohibitif. Une des raisons est que le patient doit voir un préleveur d'avoir l'échantillon de sang veineux nécessaire dessinée. Taches de sang séché ont récemment émergé comme un concept attrayant 25-28. Après un doigt simple coller le patient recueille une goutte de sang sur une carte de papier filtre spécial et la tache de sang a DRied, il peut être envoyé à un laboratoire central pour l'analyse de tacrolimus et de tout autre immunosuppresseur que le patient peut actuellement être pris. Ceci est devenu possible grâce à la mise au point de dosages LC-MS / MS hautement sensibles et spécifiques pour la quantification de tacrolimus et d'autres immunosuppresseurs dans de très petits volumes de sang tels que des taches de sang séché (typiquement 20 ul de sang) 25,29-43. Un autre avantage est que, les stratégies de collecte minimalement invasives faibles volumes d'échantillon tels que des taches de sang séché facilitent grandement suivi thérapeutique et des études pharmacocinétiques chez les petits enfants 28.
Tacrolimus est généralement mesurée en toute EDTA sang veineux 15. Les raisons sont que le tacrolimus distribue principalement dans les cellules de sang et que des études cliniques ont signalé des meilleure corrélation entre les concentrations résiduelles de tacrolimus dans le sang que dans le plasma à des événements cliniques 15,18. En comparaison, l'analyse de tacrolimus en taches de sang séché est basée sur sang capillaire qui est mélangée avec la matrice de papier-filtre. Cela pose des défis en termes de solubilisation de tacrolimus et les interférences potentielles avec l'analyse LC-MS / MS. Ici, nous présentons un test établi et validé sur la base de l'homogénéisation de la tache de sang séché en utilisant un mélangeur de balle en combinaison avec un débit élevé échantillon de colonne ligne nettoyer procédure et l'analyse LC-MS / MS. En date d'aujourd'hui, ce test a été utilisé avec succès pour la quantification de plus de cinq mille tacrolimus séchée échantillons de taches de sang pour le suivi de l'observance dans les essais cliniques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que, comme mentionné ci-dessus, la notion de médicament thérapeutique et le suivi de l'observance du tacrolimus sur la base de taches de sang séché est attrayant, il ya des défis analytiques qui vont au-delà de ceux qui sont habituellement associés à l'analyse LC-MS / MS du tacrolimus dans EDTA veineuse échantillons de sang total. Ceux-ci comprennent, mais sans y être limités, le fait que la matrice est du sang total capillaire trempé dans la matière des linters de coton de la matière de cart…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.
Materials
| Reference Materials | ||
| Tacrolimus | U.S. Pharmacopeial Convention | 1642802 |
| D2,13C-Tacrolimus | Toronto Research Chemicals Inc. | F370002 |
| Test Materials | ||
| Red blood cells | University of Colorado Hospital | W20091305500 V |
| Plasma | University of Colorado Hospital | W2017130556300Q |
| Solvents | ||
| Acetone CHROMASOLV, HPLC, ≥ 99,9 % | Sigma-Aldrich | 439126-4 L |
| Acetonitrile Optima LC/ MS, UHPLC- UV | Thermo Fisher Scientific | A955-4 |
| Isopropanol 99.9 %, HPLC | Fisher Scientific | BP2632-4 |
| Methanol Optima LC/ MS | Thermo Fisher Scientific | A452-4 |
| Water Optima LC/ MS, UHPLC- UV | Thermo Fisher Scientific | W6-4 |
| Other Chemicals | ||
| Formic acid | Thermo Fisher Scientific | A118P-500 |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 |
| Zinc sulfate | Thermo Fisher Scientific | Z68-500 |
| Laboratory Instruments and Consumables | ||
| 0.5 – 10 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008649 |
| 1,5 mL- Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-682-550 |
| 10 – 100 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008651 |
| 10 μL- pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 10XLS3 |
| 100 – 1000 µl pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008653 |
| 100 μL- pipet tips with filter, sterile | Neptune | BT 100 |
| 1000 μL- pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2940 |
| 2 – 20 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008650 |
| 2 mL- Eppendorf tube | Thermo Fisher Scientific | 02-681-258 |
| 20 – 200 µL pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS | Mettler Toledo | 17008652 |
| 20 μL- pipet tips with filter, sterile | GeneMate | P-1237-20 |
| 200 μL- pipet tips with filter | Multimax | 2938T |
| 200 μL- pipet tips with filter, sterile | Multimax | 2936J |
| 50 mL- Falcon tube | BD Falcon | 352070 |
| 300 μL inserts for HPLC vials | Phenomenex | ARO-9973-13 |
| Balance PR2002 | Mettler Toledo | 1117050723 |
| Balances AX205 Delta Range | Mettler Toledo | 1119343379 |
| Bullet Blender Homogenizer | Next Advance | BBX24 |
| Centrifuge Biofuge Fresco | Heraeus | 290395 |
| Disposable Wipes | PDI | Q55172 |
| Glass v ials, 4 mL | Thermo Fisher Scientific | 14-955-334 |
| Glass vials, 20 mL | Thermo Fisher Scientific | B7800-20 |
| Gloves, nitrile | Titan Brand Gloves | 44-100S |
| HPLC vials, 9 mm, 2 mL, clear | Phenomenex | ARO- 9921-13 |
| Lids for HPLC vials | Phenomenex | ARO- 8952-13-B |
| Needle, 18G 1.5 | Precision Glide | 305196 |
| Rack for Eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 03-448-11 |
| Rack for HPLC Vials | Thermo Fisher Scientific | 05-541-29 |
| Steel beads 0.9 – 2 mm | Next Advance | SSB14B |
| Storage boxes for freezers / refrigerators | Thermo Fisher Scientific | 03-395-464 |
| Standard multi-tube vortexer | VWR Scientific Products | 658816-115 |
| Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK | GE Whatman | 2016-05 |
| HPLC Equipment and Columns | ||
| Autosampler | CTC PAL | PAL.HTCABIx1 |
| Binary pump, Agilent 1260 Infinity | Agilent Technologies | 1260 G1312B |
| Binary pump, Agilent 1290 Infinity | Agilent Technologies | 1290 G4220A |
| Micro vacuum degasser, Agilent 1260 | Agilent Technologies | 1260 G13798 |
| Column oven, Agilent 1290 with 2 position | Agilent Technologies | 1290 G1216C |
| Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve | Agilent Technologies | 1290 G1316C |
| HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 µm particle size), 4.6 · 12.5 mm | Phenomenex | 820950-926 |
| HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 µm particle size), 4.6 · 150 mm | Phenomenex | 993967-906 |
| Tandem Mass Spectrometer | ||
| API5000 MS/MS with TurboIonspray source | AB Sciex | 4364257 |
| Mass spectrometry software | AB Sciex | Analyst 1.5.1 |
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