Disruption of bile flow results in severe inflammatory cholestatic liver injury with a characteristic time-dependent sequence of morphological alterations. Here we present a protocol for the surgical ligation of the common bile duct in mice that allows to induce a strong fibrotic response after 21 to 28 days.
सबसे रीढ़ में, जिगर अवशोषित वसा, रासायनिक पायसी और बिलीरुबिन और अन्य चयापचय उत्पादों उगलना करने के साथ ही छोटी आंत में लिपिड के पाचन सक्षम करने के लिए आवश्यक है कि पित्त पैदा करता है। जिगर में, extrahepatic पित्त प्रणाली की प्रयोगात्मक रुकावट पित्तस्थिरता और सूजन periportal क्षेत्रों से होने वाले एक मजबूत तंतुमय प्रतिक्रिया में जिसके परिणामस्वरूप की ओर जाता है कि रोग की घटनाओं की एक जटिल झरना शुरू की। इसलिए, आम पित्त नली की शल्य बंधाव कृन्तकों में प्रतिरोधी पित्तरुद्ध चोट प्रेरित करने के लिए और अनुचित पित्त प्रवाह से प्रेरित इन pathophysiological तंत्र कायम करना है कि आणविक और सेलुलर घटनाओं का अध्ययन करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया मॉडल बन गया है। हाल के वर्षों में विभिन्न शल्य चिकित्सा तकनीक विशिष्ट अनुसंधान प्रश्नों के लिए पुनः कनेक्शन या reanastomosis पित्त नली बंधाव (बीडीएल) के बाद, उदाहरण के लिए, आंशिक बीडीएल, या अन्य microsurgical विधियों की अनुमति देते हैं कि या तो वर्णित किया गया है। हालांकि, सबसे अक्सर इस्तेमाल किया मॉडल 21-28 दिनों के बाद एक मजबूत तंतुमय प्रतिक्रिया लाती है कि आम पित्त नली का पूरा बाधा है। मृत्यु दर की वजह से संक्रामक जटिलताओं या तकनीकी अशुद्धियों को उच्च किया जा सकता है। यहाँ हम 1959 में रसेल और Burch द्वारा माने पशु कल्याण के लिए 3R नियम के अनुसार एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तंतुमय प्रतिक्रिया प्रेरित है कि चूहों में बीडीएल मॉडल के लिए एक विस्तृत शल्य प्रक्रिया प्रदान करते हैं।
लिवर फाइब्रोसिस मैट्रिक्स उत्पादक यकृत तारामय कोशिकाओं की बातचीत का एक जटिल नेटवर्क और जिगर-निवासी और घुसपैठ कोशिकाओं को रक्त कोशिकाओं 1,2 की एक विस्तृत विविधता से निकलती है कि अत्यधिक उत्पादन और बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के संचय के रूप में परिभाषित किया गया है। यकृत फाइब्रोसिस विभिन्न उत्तेजनाओं की एक भीड़ की वजह से हो सकता है फाइब्रोसिस अंतर्निहित आणविक तंत्र आम तौर पर बहुत समान हैं। यकृत क्षति के बाद, आणविक और सेलुलर परिवर्तन का एक अत्यधिक करवाया कार्यक्रम शुरू की है। इस कार्यक्रम में सूजन का संकेत है, monocytes / मैक्रोफेज और यकृत तारामय कोशिकाओं के बीच एक घनिष्ठ संपर्क होता है कि myofibroblasts, ईसीएम बयान और जिगर ऊतक अखंडता 3 की लगातार संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन के लिए तारामय सेल सक्रियण और transdifferentiation में अंत परिणाम पर। यकृत तारामय कोशिकाओं की सक्रियता विशेष रूप से जिगर के साथ भड़काऊ संकेतों और बातचीत के द्वारा संचालित है(Kupffer कोशिकाओं यानी) residental मैक्रोफेज। पैथोजन जुड़े आणविक पैटर्न ऐसे टोल की तरह रिसेप्टर्स के रूप में विशिष्ट पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स द्वारा मान्यता प्राप्त हैं कि भड़काऊ प्रक्रिया तीन ड्राइव कि भड़काऊ साइटोकिन्स और chemokines की एक भीड़ की अभिव्यक्ति और स्राव को ट्रिगर है कि अलग अलग रास्ते में से एक जटिल नेटवर्क के माध्यम से संकेत जब सक्रिय। रोग-उत्पादन कारक हटा दिया जाता है जब भड़काऊ प्रतिक्रिया और गठन यकृत अपमान केवल अस्थायी है। चोट बनी रहती है इसके विपरीत, यदि, जीर्ण सूजन जिगर और निशान ऊतक गठन के द्वारा सामान्य जिगर पैरेन्काइमा के प्रगतिशील प्रतिस्थापन में जिसके परिणामस्वरूप अग्रभूमि में अभिव्यक्ति और ईसीएम भीड़ के संचय के भीतर विकसित।
मानव में यकृत fibrogenesis एक दुनिया भर में नैदानिक समस्या है, तीव्र और जीर्ण यकृत विफलता के कई प्रयोगात्मक कृंतक मॉडल पिछले दशकों के दौरान स्थापित किया गया है। म्यू मेंrine प्रणाली उदाहरण के लिए, आम मॉडल महत्वपूर्ण है कि प्रभावित विभिन्न hepatotoxins की एक किस्म के प्रशासन, आम पित्त नली के बंधाव, प्रतिरक्षा की मध्यस्थता जिगर चोट की प्रेरण, और जीन दोष के लक्षित परिचय या transgenes की ठीक इसके विपरीत overexpression हैं जिगर फाइब्रोसिस 4 के रोगजनन में शामिल रास्ते संकेतन।
कृन्तकों में आम पित्त नली के ligation कई वर्षों से 5-8 के लिए अनुसंधान के क्षेत्र में एक प्रायोगिक प्रक्रिया के रूप में बाहर किया गया है। कृन्तकों में लंबे समय तक पित्त नली बंधाव (बीडीएल) के लिए एक पहले अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल पहले से ही अधिक से अधिक तीन दशक पहले 9 अब प्रस्तुत किया गया था। इस प्रोटोकॉल में केन्युलेशन / रुकावट और बंधाव दोनों मानव पित्त सिरोसिस 9 में मनाया उन लोगों के बराबर थे कि रूपात्मक बदलाव के साथ चूहों में सिरोसिस की एक उच्च उपज प्रेरित किया। संबंधित प्रोटोकॉल शल्य प्रक्रिया अपेक्षाकृत तेजी से लागू है, सरल है, और जानवरों के जीवित रहने की दरों में 95% से अधिक के साथ उच्च रहे हैं। शास्त्रीय चूहे केन्युलेशन / बाधा प्रोटोकॉल में, 2 सेमी की एक छोटी चीरा सिर्फ असिरूप प्रक्रिया नीचे किया जाता है। इसके बाद, एक प्रवेशनी पित्त नली के समीपस्थ भाग में डाला और रेशम sutures के साथ अपनी स्थिति में तय हो गई है। एक अगले चरण में, प्रवेशनी के बाहर का भाग सही कम वृत्त का चतुर्थ भाग 9 में subcutaneously midline चीरा के निचले अंत के माध्यम से रखा और दफन, तीन समुद्री मील के साथ बाधित है। अंत में, पेट बंद हो गया है और जानवरों को ठीक करने के लिए अनुमति दी जाती है। बंधाव प्रोटोकॉल में, चूहों के साथ या संयुक्ताक्षर 9 के बीच पित्त नली के विच्छेदन के बिना या तो आम पित्त नली के दोहरे बंधाव के अधीन हैं।
इस प्रयोगात्मक मॉडल अच्छी तरह से स्वीकार कर लिया और जिगर पित्तस्थिरता और फाइब्रोसिस प्रेरित करने के लिए प्रयोगशालाओं के सैकड़ों की संख्या में दुनिया भर में प्रयोग किया जाता है। यह intrahepatic पित्त उपकला सेल प्रसार, myofibroblastic differentiatio लाती हैपोर्टल fibroblasts की एन के आसपास ईसीएम 10,11 के एक बेहद प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति और बयान में जिसके परिणामस्वरूप, पित्त उपकला कोशिकाओं proliferating। इसलिए, चूहों और चूहों में इस मॉडल के आवेदन के यकृत में सूजन और फाइब्रोसिस के रोगजनन को समझने के लिए कि लक्ष्य वैज्ञानिकों के बीच लोकप्रिय किया जा रहा है।
हमारी प्रयोगशाला में, हम बड़े पैमाने पर यकृत fibrogenesis की विशेष आणविक और सेलुलर पहलुओं की जांच के लिए और उपन्यास antifibrotic अवधारणाओं और दवाओं 12-15 का परीक्षण करने के लिए लक्ष्य कई प्रयोगात्मक अध्ययन में चूहों में अतीत में इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल किया है।
हाल ही में, हम murine व्यवस्था करने के लिए इस पद्धति अनुकूलित और पित्त नली बंधाव सर्जरी भी चूहों 16-18 में कम भिन्नता और मृत्यु दर के साथ समय पर निर्भर फाइब्रोसिस की स्थापना के लिए एक आकर्षक मतलब है कि पाया। जानवरों के छोटे आकार के, हालांकि, संज्ञाहरण के संबंध में कुछ महत्वपूर्ण संशोधन, शल्य interv कारणention के और बाद के उपचार अवलोकन इस मॉडल में विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। पूर्ण अनुकूलन निम्नलिखित प्रोटोकॉल में और साथ वीडियो दस्तावेज में संक्षेप।
पित्तरुद्ध जिगर चोट जीर्ण जिगर की बीमारी के साथ रोगियों में यकृत फाइब्रोसिस और सिरोसिस के विकास के लिए प्रमुख प्रेरणा कारकों में से एक है। इन रोगों हलका स्वास्थ्य देखभाल की लागत का उत्पादन है कि इस तथ्य पर आधारित है, यह कई शोधकर्ताओं चल रही यकृत फाइब्रोसिस की रोगजनक तंत्र को समझने की कोशिश कर रहे हैं कि सुबोध है। इसलिए, प्रयोगात्मक मॉडल यकृत में सूजन, फाइब्रोसिस और सिरोसिस एक करने के लिए नेतृत्व कि जटिल तंत्र के विभिन्न पहलुओं की नकल है कि उत्पन्न किया गया है।
सर्जिकल बीडीएल चूहों और चूहों 4,23,24 में प्रतिरोधी पित्तरुद्ध चोट प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि सबसे व्यापक प्रयोगात्मक मॉडलों में से एक है। प्रोटोकॉल के अधिकांश में, जानवरों anesthetized हैं और एक midsection laparotomy किया जाता है। इसके बाद, पित्त नली उदर गुहा से खुला है और शल्य चिकित्सा सुतली का उपयोग करते हुए दो बार ligated। एक परिणाम के रूप में, चूहों और चूहों इस सर्जरी डी प्राप्त है किevelop पहली बार में periportal क्षेत्रों में 25 से उत्पन्न कि एक मजबूत तंतुमय प्रतिक्रिया। वर्षों के दौरान कई अलग अलग सर्जिकल तकनीक और संशोधनों का वर्णन किया गया है। विशेष प्रक्रियाओं भी बीडीएल 23 के बाद पुनः कनेक्शन या reanastomosis अनुमति देते हैं। अन्य तकनीक काफी कम नेक्रोसिस गठन और फलस्वरूप hepatocyte प्रसार 24 में जिसके परिणामस्वरूप आंशिक बीडीएल पर आधारित हैं। Cholecystitis के गठन से बचाता है कि पित्ताशय की थैली (पित्ताशय-उच्छेदन) के बाद हटाने के साथ संयोजन में आंशिक बीडीएल भी तीव्र पित्तस्थिरता के लिए एक उत्कृष्ट प्रयोगात्मक मॉडल का प्रतिनिधित्व करता है। यह मानव की स्थिति में 24 के करीब है कि एक मॉडल होने के लिए प्रस्तावित किया गया था। और वास्तव में, इस मॉडल की स्थापना के दौरान, यह पहले से ही यह reproducibly केवल न्यूनतम ऊतकीय ऊतक चोट के साथ पित्तस्थिरता कारण बनता है और पुरानी पित्तस्थिरता 25 के लिए आगे बढ़ना नहीं है कि प्रदर्शन किया गया। इसलिए, यह इस मॉडल अक्षां के अध्ययन के लिए आदर्श है कि सुझाव दिया गया थाउलट पित्तस्थिरता 24 की ई प्रभाव। इससे भी अधिक परिष्कृत तरीके microsurgery पर आधारित है और एक तेजी से और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य रास्ता ही जिगर 26 के चयनित भागों में पित्तरुद्ध जिगर चोट दण्ड करने की अनुमति कर रहे हैं।
मूल बीडीएल प्रोटोकॉल से इन परिष्कृत संशोधनों विशिष्ट अनुसंधान सवालों की जांच करने में बहुत मददगार साबित हो गया है हालांकि, कई प्रयोगशालाओं दुनिया भर में मूल रूप से पित्तरुद्ध जिगर फाइब्रोसिस के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय मॉडल के रूप में बीडीएल मॉडल को रोजगार का उद्देश्य। हालांकि, कई जटिलताओं को काफी हद तक तकनीकी अशुद्धियों से परहेज नहीं कर रहे हैं, तो इस मॉडल के आधार पर प्राप्त परिणामों के reproducibility और विश्वसनीयता को बदल सकता है कि हो सकता है। के दौरान या तेजी से सर्जरी के बाद हो सकता है – उदाहरण के लिए, पित्त नली के साथ रक्त वाहिकाओं की चोट से संबंधित जटिलताओं से खून बह रहा (4 3 आंकड़े देखें)। बाद में cardiodepression या आर के साथ संज्ञाहरण की overdosingespiratory विफलता भी प्रक्रिया का परिहार्य जटिलताओं हैं। टांके सही रूप पेरिटोनियल गुहा में प्रदर्शन किया और पित्त लीक नहीं कर रहे हैं पेरिटोनिटिस से पूति को लेकर गंभीर संक्रमण, प्रयोग की पूरी अवधि के दौरान हो सकता है। सर्जरी के दौरान आंत को आकस्मिक चोटों भी पेरिटोनिटिस करने के लिए ले जा सकता है। इसलिए, यह सख्त से निपटने के दिशा-निर्देशों के अनुपालन में हैं जो मानकीकृत प्रोटोकॉल दृढ़ता से अपेक्षा की जाती है कि स्पष्ट है। यह शर्त भी हाल ही में 2013 में 1 नया पशु कल्याण नियम लागू किया है, जो यूरोपीय संघ के देशों के भीतर की मांग की गई थी। इस विनियमन के साथ जुड़े रहे हैं कि संबंधित आवश्यकताओं को नए नहीं हैं और पहले से ही 1959 में प्रस्तावित किया गया था, रसेल और Burch एक नैतिक सुझाव दिया जब मुख्य रूप से एक प्रतिस्थापन, शोधन और कमी (3R) सिद्धांत 27 के आधार पर किया जाता है कि जानवरों के साथ वैज्ञानिक प्रयोगों का आयोजन के लिए रूपरेखा।
Outlin निम्नलिखित जबएड प्रोटोकॉल तकनीकी अशुद्धियों से उत्पन्न हो सकती है कि केवल कुछ उलझने हैं। तीन विशिष्ट मुद्दों के बजाय कम आवृत्ति में उत्पन्न हो सकती है।
सभी सर्जिकल प्रक्रियाओं के साथ के रूप में, संवेदनाहारी की अधिक मात्रा विशेष रूप से हाइपोथर्मिया के साथ संयोजन में पशुओं के लिए खतरे का एक संभावित स्रोत है। सर्जरी के दौरान हृदय जटिलताओं होते हैं, निश्चेतक की आपूर्ति तुरंत रोका जाना चाहिए और ऑपरेटर माउस के लिए संभव ऑक्सीजन के रूप में ज्यादा प्रदान करने के लिए प्रयास करना चाहिए। यह हवा से भरा है और बिगड़ा पशु के मुंह में पंप है कि एक छोटे से प्लास्टिक सिरिंज के माध्यम से किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से प्रभावित पशु की सुनवाई के लिए एक छोटा सा Peleusball के उपयोग के पुनरोद्धार की प्रक्रिया के लिए अक्सर मददगार है।
घाव भरने में समस्याएं
बीडीएल सर्जरी के बाद, चूहों अपने खुद के गले में तेजी या अन्य जानवरों के उन नुकसान पहुंचा सकते हैं। यदि ऐसा होता है, संबंधित चूहों को अलग-अलग होना चाहिएबंदी। खुले घावों के साथ जानवरों घाव के आसपास के क्षेत्र धीरे एक मानक एंटीसेप्टिक के साथ निष्फल और घाव फिर से सिलना किया जाना चाहिए, anesthetized किया जाना चाहिए। अगले तीन दिनों के दौरान, इन जानवरों के घाव नियमित रूप से (दो से तीन बार एक दिन) का निरीक्षण किया जाना चाहिए।
पेट या जलोदर के गठन की Distensions जीवाणु संक्रमण के लिए संकेत कर रहे हैं। ये कारण सर्जरी के दौरान गैर बाँझ काम करने के लिए हो सकता है। संक्रमण की सभी तरह की एक मानवीय समापन बिंदु के रूप में बिना किसी अपवाद के नियंत्रित किया जाना चाहिए और प्रभावित जानवरों का बलिदान किया जाना चाहिए।
हम एक आसान लागू करने के लिए सरल है और एक उच्च reproducibility के साथ संयुक्त केवल कम पशु मृत्यु दर उदाहरण भी देते हैं कि चूहों में बीडीएल के प्रदर्शन की अनुमति देता है कि प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए प्रदान की है। शल्य प्रोटोकॉल के सभी जल्दी से कुशल वैज्ञानिकों द्वारा गिरफ्तार किया जा सकता है। पूरा प्रयोग के दौरान, जानवरों के 37 डिग्री सेल्सियस पर एक वार्मिंग की थाली पर रखा है और स्थायी रूप से जुड़े हुए हैंएक संज्ञाहरण व्यवस्था करने के लिए दर्द और संकट को कम करने। सर्जरी के लिए, पेट एक midline laparotomy और यह विदारक बिना डबल ligated पित्त नली के साथ खोला जाता है। यहाँ पर चर्चा कर रहे थे कि प्रतिनिधि परिणाम जिगर आकारिकी (सूजन, फाइब्रोसिस, सिरोसिस) के संबंध में प्ररूपी परिवर्तन अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं और fibrogenesis के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए अनुमति दिखाना है कि (उदाहरण के लिए।, दीक्षा, सूजन, प्रगति, अंतिम चरण की बीमारी) निर्धारित समय-बिंदुओं पर।
हम अपने प्रोटोकॉल का सारांश सफलतापूर्वक अन्य प्रयोगशालाओं में इस फाइब्रोसिस मॉडल स्थापित करने के लिए और विभिन्न स्थानों पर विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम की गारंटी करने के लिए आवश्यक है कि सीखने की अवस्था को छोटा करने में मदद मिलेगी कि उम्मीद है। इस प्रकार हम प्रस्तुत प्रोटोकॉल 1959 में रसेल और Burch से अपेक्षा की गई थी कि 3R सिद्धांत का समर्थन करता है और वर्तमान में कई देशों के वाई में लागू कर रहे हैं कि नए पशु कल्याण के नियमों के आधार का प्रतिनिधित्व करता है कि लगता हैपतली यूरोपीय फ्रेमवर्क।
The authors have nothing to disclose.
लेखकों जर्मन रिसर्च फाउंडेशन (SFB / TRR57, Q3 और Q2) की वित्तीय सहायता को स्वीकार करना होगा। लेखकों तस्वीरों को तैयार करने में उनकी मदद के लिए Mareike Schulz, पास्कल Paschenda, और Klaudia Warzecha धन्यवाद।
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Isoflurane | Forene Abbott | B 506 | |
Shaver Favorita II | Aeskulap | GT104 | |
Cutter head | Aeskulap | GT730 | |
Bepanthen eye and nose ointment | Bayer Vital GmbH | 6029009.00.00 | |
Warming plate and controller | Labotect | HP 062 | |
Fluovac anesthesia system | Harvard Apparatus | 34-1030 | |
ISOFLO (Isoflurane Vapor) vaporiser | Eickemeyer | 4802885 | |
Scotch Tape | commercially available | ||
Tissue paper | commercially available | ||
Durapore silk tape | 3M | 1538-1 | |
Cotton Gauze swabs | Fuhrmann GmbH | 32014 | |
Poly-Alcohol Haut…farblos Antisepticum | Antiseptica GmbH | 72PAH200 | |
Raucodrape OR adhesive drapes | Lohmann & Rauscher GmbH | 33013 | |
Scissor | Fine Science Tools Inc. | 14074-11 | |
Graefe forceps straight | Fine Science Tools Inc. | 11050-10 | |
6-0 Mersilk suture | Ethicon | K889H | Silk, non-absorbable/Abdominal closure |
Needle holder Mathieu | Fine Science Tools Inc. | 12010-14 | |
Colibri retractor | Fine Science Tools Inc. | 17000-03 | |
Cotton swabs | Noba Verbandmittel | 974202 | |
Cotton swabs | Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH | 1032238 | |
25mL beaker | Schott Duran | 50-1150 | |
Isotonic (0.9%) NaCl solution | DeltaSelect GmbH | PZN 00765145 | |
Micro-serrations forceps Moria MC31 | Fine Science Tools Inc. | 11370-31 | Bile duct separation |
5-0 Mersilene suture | Ethicon | EH6731H | Polyester, non-absorbable/Bile duct ligation |
5mL syringe | BD Discardit II | 300296 | |
1mL syringe | BD Plastipak | 300013 | |
Sterican needle 26 G x 1 | B. Braun | 4657683 | |
Buprenorphine | Essex Pharma | 997.00.00 | Analgeticum, 0.1 mg/kg |
Infrared lamp | Petra Electric | IR 11 |