Синтез индоксил-гликозидов для обнаружения гликозидазой деятельности
Summary
Indoxyl glycosides are well-established and widely used tools for enzyme screening and enzyme activity monitoring. Especially for glucose type structures previous syntheses proved to be challenging and low yielding. Our novel approach employs indoxylic acid esters as precious intermediates to yield a considerable number of indoxyl glycosides in good yields.
Abstract
Indoxyl glycosides proved to be valuable and versatile tools for monitoring glycosidase activities. Indoxyls are released by enzymatic hydrolysis and are rapidly oxidized, for example by atmospheric oxygen, to indigo type dyes. This reaction enables fast and easy screening in vivo without isolation or purification of enzymes, as well as rapid tests on agar plates or in solution (e.g., blue-white screening, micro-wells) and is used in biochemistry, histochemistry, bacteriology and molecular biology. Unfortunately the synthesis of such substrates proved to be difficult, due to various side reactions and the low reactivity of the indoxyl hydroxyl function. Especially for glucose type structures low yields were observed. Our novel approach employs indoxylic acid ester as key intermediates. Indoxylic acid esters with varied substitution patterns were prepared on scalable pathways. Phase transfer glycosylations with those acceptors and peracetylated glycosyl halides can be performed under common conditions in high yields. Ester cleavage and subsequent mild silver mediated glycosylation yields the peracetylated indoxyl glycosides in high yields. Finally deprotection is performed according to Zemplén.
Introduction
В течение долгого времени производство индиго был экономически очень важный процесс. Перед крупномасштабных химических синтезов дал дешевый доступ к индиго, предшественники были получены из природных источников с дохристианских времен. Выращивание индиго обеспечения растений (естественно индиго) в Европе стал неблагодарным в 17-м веке, как количество индиго предшественники индийской индиго (0,2-0,8%) составляет около 30 раз выше. В конце 19-го века химического синтеза индиго подавил обычный выращивание 1,2.
Indigo предшественники, происходящие в растениях включают индикана (1), Insatan A (2) и Isatan B (3) (рис 1). Все они состоят из индоксил мотива, связанного с гликозильного остатка. Расщепление гликозидной связи, например, с помощью ферментативного гидролиза, приводит к выделению индоксил (4). Сама индоксил практически бесцветны, но могут быть быстро окисляется с образованием индиго Краситель (5). Это чувствительная реакция была адаптирована в биохимии, бактериологии, гистохимии и молекулярной биологии для мониторинга активности ферментов. Скрининг активности в естественных условиях без выделения или очистки ферментов, а также экспресс-тесты на чашках с агаром или в растворе (например, бело-голубым скрининга, микро-скважин) возможно. В зависимости от остатка (например, сложные эфиры, гликозиды, сульфаты), связанного с индоксил фрагмента, пригодными субстратами в различных классов ферментов (например, эстераз, глюкозидазы, сульфатазы) были разработаны 3. В следующем внимание будет уделено формированию и применению индоксил гликозидов.
Рисунок 1: Природные предшественники индиго и формирование красителя индиго путем гидролиза.цель = "_ пустое"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Замещение картина индоксил фрагмента определяет цвет и физические свойства полученного красителя индиго. Наиболее распространенные шаблоны замещения 5-бром-4-хлор (сокращенно от X; зеленовато-голубой), 5-бром (синий) и 5-бром-6-хлор (пурпурный), так как они образуют мельчайшие частицы красителя, делают не образуют гранулы и имеют наименьший диффузию из участков гидролиза. Последнее свойство особенно важно для естественных условиях экспериментов в 3.
Первый доклад о indigogenic метода для обнаружения эстеразы был опубликован в 1951 году и Barrnett Селигман, который занятого индоксил ацетат и бутират 4. О десятилетие спустя indigogenic принцип был адаптирован для локализации глюкозидазы млекопитающих 5. До сих пор несколько индоксил гликозидов были разработаны, хотя их синтез оказался трудно. Большинство синтезов на основе использования в -acetylated индоксил N в качестве акцептора и соответствующих гликозилгалогенидом донора 6-14. Гликозилирование проводят в ацетоне с помощью гидроксида натрия. В этих условиях количество побочных реакций происходит, значительно уменьшая выход. Специально для глюкозы структур типа очень низкие выходы гликозилирования сообщалось (например, 15% (N-ацетил-5-бром-4-хлор-индол-3-ил) -2,3,4,6-тетра-О-ацетил -β-ᴅ-глюкопиранозид 6 и 26% (N-ацетил-5-бром-4-хлор-индол-3-ил) -2,3,2 ', 3', 4'-пента вывода -acetyl- β-ᴅ-xylobioside 14 в более недавний пример). Через новый подход, используя сложные эфиры indoxylic кислоты, значительное количество индоксил гликозидов были получены с хорошим выходом (например, (N-ацетил-5-бром-4-хлор-индол-3-ил) -2,3,4, 6-тетра-О-ацетил-β-ᴅ-глюкопиранозид выход 57%).
_content "> Следующий протокол описывает простой синтез indoxylic кислоты аллилового эфира (5-бром-4-хлор) и на их основе синтеза с индоксил гликозида (X-Gal). Простой модельный эксперимент показывает ферментную реактивность β- галактозидазы с использованием X-Gal.Protocol
Representative Results
Discussion
Owing to poor yields and limitations, especially for glucose type structures and more complex saccharides, a novel synthetic approach towards indoxyl glycosides was developed. Indoxylic acid esters proved to be precious key intermediates and were obtained in a modular, scalable pathway. All steps are high yielding and due to cheap starting materials and easy workup multi-gram syntheses are possible. The advantage of the allyl ester approach is the blocking of the reactive 2-position. Thus yield decreasing side reactions …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Support of this work by Glycom A/S, Copenhagen, Denmark, is gratefully acknowledged.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Acetic anhydride | Grüssing | 10298 | Corrosive, flammable |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 608-001-00-3 | Harmful, flammable |
| Allyl alcohol | Aldrich | 453021 | Harmful, dangerous for the environment |
| Amberlite IR-120 H+ | Fluka | 06428 | Irritant |
| Bromoacetic acid | Merck | 802260 | Corrosive, toxic, dangerous for the environment |
| 4-Bromo-3-chloro-2-methylaniline | ABCR | AB 171687 | Irritant |
| Dichloromethane | ACROS | 326850010 | Harmful |
| Diethyl ether | Grüssing | 10274 | Harmful, extremly flammable |
| Dimethylformamide | ACROS | 348430010 | Harmful, flammable |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | 41648 | |
| Ethyl acetate | Sigma-Aldrich | 607-022-00-5 | Irritant, flammable |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | AppliChem | A1103.0500 | Irritant |
| ß1,3-Galactosidase, Recombinant, E. coli | Calbiochem | 345795 | |
| Hydrochloric acid | VWR | 20252.290 | Corrosive |
| Magnesium sulfate hydrate | Merck | 105885 | |
| Methanol | ACROS | 326950010 | Toxic, flammable |
| Morpholine | Janssen Chimica | 15.868.57 | Corrosive, flammable |
| Peroleum ether | Azelis | 111053 | Flammable, irritant, dangerous for the environment |
| Potassium carbonate | Grüssing | 12005 | Corrosive |
| Potassium permanganate | Grüssing | 12056 | Harmful, oxidising |
| Potassium tert-butoxide | Merck | 804918 | Corrosive, flammable |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 613-002-00-7 | Harmful, flammable |
| Silver acetate | Fluka | 85140 | Irritant, dangerous for the environment |
| Sodium bicarbonate | Grüssing | 12144 | Corrosive |
| Sodium hydride | Merck | 814552 | Corrosive, flammable |
| Sodium hydroxide | Riedel-de Häen | S181200 | Corrosive |
| Sodium methanolate | Merck | 806538 | Corrosive, flammable |
| Sodium sulfate | Grüssing | 12175 | |
| Tetrabutylammonium hydrogensulfate | Lancaster | 5438 | Harmful |
| Tetrahydrofurane | Sigma-Aldrich | 87371 | Harmful, flammable |
| Tetrakis(triphenylphosphine)palladium(0) | Sigma-Aldrich | 216666 | |
| Triphosgene | Fluka | 15217 | Toxic |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride | Sigma | T-3253 | Irritant |
References
- Clark, R. J. H., Cooksey, C. J., Daniels, M. A. M., Withnall, R. Indigo, Woad, and Tyrian Purple: Important Vat Dyes from Antique to the Present. Endeavour. 17, 191-199 (1993).
- Hunger, K. . Industrial Dyes: Chemistry, Properties, Applications. , (2003).
- Kiernan, J. A. Indigogenic Substrates for Detection and Localization of Enzymes. Biotechn. Histochem. 82, 73-103 (2007).
- Barnett, R. J., Seligman, A. M. Histochemical Demonstration of Esterases by Production of Indigo. Science. 114, 579-582 (1951).
- Pearson, B., Andrews, M., Grose, F. Histochemical Demonstration of Mammalian Glucosidase by Means of 3-(5-Bromoindolyl)-β-ᴅ-glucopyranoside. Exp. Biol. Med. 108, 619-623 (1961).
- Anderson, F. B., Leaback, D. H. Substrates for the Histochemical Localization of some Glycosidases. Tetrahedron. 12, 236-239 (1961).
- Van Dort, M. E., Lee, K. C., Hamilton, C. A., Rehemtulla, A., Ross, B. R. Radiosynthesis and Evaluation of 5-[125I]Iodoindolyl-3-yl-β-ᴅ-galactopyranoside ([125I]IBDG) as a β-Galactosidase Imaging Radioligand. Mol. Imaging. 7, 187-197 (2008).
- Yoshida, K., Iino, N., Koga, I. Syntheses of Halogen Substituted β-ᴅ-Glucuronides and Their Hydrolysis by Rabbit Liver β-Glucoronidase. Chem. Pharm. Bull. 32, 1759-1769 (1975).
- Horwitz, J. P., et al. Substrates for Cytochemical Demonstartion of Enzyme Activity I. Some Substituted 3-Indolyl-β-ᴅ-glycopyranosides. J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).
- Eschenfelder, V., Brossmer, R. 5-Bromo-indol-3-yl 5-Acetamido-3,5-dideoxy-α-ᴅ-glycero-ᴅ-galactononulopyranosidic Acid, a Novel Chromogenic Substrate for the Staining of Sialidase Activity. Glycoconjugate J. 4, 171-178 (1987).
- Fujii, I., Iwabuchi, Y., Teshima, T., Shiba, T., Kikuchi, M. X-Neu5Ac: A Novel Substrate for Chromogenic Assay of Neuraminidase Activity in Bacterial Expression Systems. Bioorg. Med. Chem. 1, 147-149 (1993).
- Berlin, W., Sauer, B. In situ Color Detection of α-ʟ-Arabinofuranisodase, a "No-Background" Reporter Gene, with 5-Bromo-3-indolyl-α-ʟ-arabinofuranoside. Anal. Biochem. 243, 171-175 (1996).
- Marmuse, L., et al. New Chromogenic Substrates for Feruloyl Esterases. Org. Biomol. Chem. 6, 1208-1214 (2008).
- Kaneko, S., Kiaoka, M., Kuno, A., Hayashi, K. Syntheses of 4-Methylumbelliferyl-β-ᴅ-Xylobioside and 5-Bromo-3-Indolyl-β-ᴅ-Xylobioside for Sensitive Detection of Xylanase Activity on Agar Plates. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64, 741-745 (2000).
- Robertson, A. J. Syntheses of Glucosides. Part I. The Synthesis of Indican. Chem. Soc. , 1937-1943 (1927).
- Robertson, A., Waters, R. B. J. Synthese of Glucosides. Part VII. The Synthesis of 6-Bromoindican. Chem. Soc. , 2239-2243 (1929).
- Böttcher, S., Thiem, J. Indoxylic Acid Esters as Convenient Intermediates Towards Indoxyl Glycosides. Eur. J. Org. Chem. , 564-574 (2014).
- Böttcher, S., Hederos, M., Champion, E., Dékány, G., Thiem, J. Novel Efficient Routes to Indoxyl Glycosides for Monitoring Glycosidase Activities. Org. Lett. 15, 3766-3769 (2013).
- Böttcher, S., Thiem, J. Facile Preparation of Indoxyl- and Nitrophenyl Glycosides of Lactosamine and Isolactosamine. RSC Adv. 4, 10856-10861 (2014).
