Комплексная оценка зародышевой линии химической токсичности Использование нематоды<em> Caenorhabditis Элеганс</em
Summary
We describe the detailed steps of a high-throughput chemical assay in the nematode Caenorhabditis elegans used to assess germline toxicity. In this assay, disruption of germline function following chemical exposure is monitored using a fluorescent reporter specific to aneuploid embryos.
Abstract
Определение репродуктивную токсичность тысяч химических веществ, присутствующих в окружающей среде был одним из самых изысканных проблем в области гигиены окружающей среды. Это связано, в частности к нехватке модельных систем, которые могут (1) точно воспроизводят ключи особенности процессов размножения и (2) сделать это в средней и высокой пропускной образом, без необходимости большого числа позвоночных животных.
Здесь мы опишем метод количественного нематоды C. Элеганс, что позволяет быстро идентифицировать зародышевой линии токсикантов путем мониторинга индукцию анеуплоидных эмбрионов. Благодаря использованию в GFP репортер линии, ошибки в сегрегации хромосом в результате зародышевой линии разрушения легко визуализировать и количественно с помощью автоматизированной флуоресцентной микроскопии. Таким образом, скрининг определенного набора соединений для его токсичности могут быть выполнены в виде пластины с 96- до 384-а в течение нескольких дней. Вторичный анализ положительного чего можно выполнить, чтобы определить, является ли возникла хромосомных аномалий от мейоза нарушения или ранних эмбриональных ошибок хромосом. В целом, этот анализ представляет собой быстрый стратегию первого прохода для быстрой оценки зародышевой линии дисфункции следующей химического воздействия.
Introduction
Есть около 87000 химических веществ, зарегистрированные для торговли в Соединенных Штатах, но только небольшое количество из них были протестированы для потенциальных последствий для здоровья 1. Из тех, что были проверены, только часть была оценена для эффектов репродуктивного здоровья, отчасти из-за трудностей в определении изменения ранних репродуктивных событий у млекопитающих, особенно во время развития женского зародышевых клеток и дифференцировки. В самом деле, первого мейотического события происходят во время ранней стадии эмбрионального развития у самок млекопитающих, и, таким образом, трудно получить доступ и собрать в числах, пригодных для целей скрининга.
Зародышевой линии обеспечивает важную связь между поколениями, и ее соответствующая функция зависит от четкое исполнение сложной программы клеточного и хромосомного деления называется мейоза. Нарушение регуляции мейоза процесса может привести к снижению рождаемости и производствагамет и эмбрионов с аномальной числа хромосом, состояние называется анеуплоидии. Хромосомные ошибки сегрегации в мейозе являются весьма актуальными для здоровья человека. Хромосомные аномалии являются общими, с частотой 1 случай на 150 живорожденных, трисомии 21, 18 и 13, а также X и Y ошибок хромосом, являющихся наиболее распространенных типов 2,3. Кроме того, врожденные пороки развития, в том числе хромосомных происхождения, являются ведущей причиной смерти младенцев в США 4 мысль, что влияние окружающей среды может повлиять на хромосомный сегрегации и поведение не является новой 5, но все еще плохо изучены. Поэтому очень важно исследовать, какие из химических веществ, внесенных в нашей среде мешают человеческого плодородия, раннего развития и общего репродуктивного здоровья.
В свете этих ограничений моделей млекопитающих, мы разработали экраном анализа с высокой пропускной испытать токсическое действие на репродуктивную аскариды <EM> C. Элеганс. Мы мобилизовали несколько важных особенностей, предлагаемых этой широко используется генетическая модель системы, такие как ее небольшой размер, низкая стоимость, короткий цикл воспроизводства, высокой долей половых клеток и легкости манипуляции 6. Черви могут быть выращены в 96-луночных планшетах или в высоких жидких культурах объемом и из-за их прозрачности может быть непосредственно отображается на пластинах для обнаружения флуоресцентных репортеров. Анализ, описанный ниже пользуется этими характеристиками и использует червя штамма, содержащего люминесцентные репортером Pxol-1 :: GFP для определения зародышевой линии нарушения и индукцию эмбрионального анеуплоидии.
Использование этого репортера деформации на основе, как правило редком возникновении мужчин в основном гермафродитов населения червя. Эти мужчины (<0,2%), естественно, происходят от ошибок в сегрегации в Х-хромосоме 7. Однако, как нарушение зародышевой линии часто приводит к ошибкам в сегрегации аутосоми heterochromosomes, коррелируется как с повышенной заболеваемости мужчин фенотипа (X missegregation), а также эмбриональной летальности (аутосомно missegregation). Для легко обнаружить индукцию мужчин в обход проблемы эмбриональной летальности, мужчина-промотор (XOL-1) используется для управления экспрессией GFP у ранних эмбрионов еще, содержащихся в матку червя. Таким образом, появление GFP-экспрессирующих эмбрионов используется в качестве посредника для присутствии анеуплоидных эмбрионов. Этот метод был ранее использован для идентификации генов, участвующих в обеспечении зародышевой линии и мейоза 8,9. Адаптированный к химической скрининга, этот штамм используется в среде с экрана с высокой пропускной способностью. Важно отметить, что штамм верно сообщает aneugenicity химических веществ и, следовательно, отношение к млекопитающих репродуктивных конечных точек 10. Анализ, описанный здесь будет особенно полезно токсикологов в фармацевтической и химической промышленности настроек ищутбыстро оценить токсичности химических веществ в области репродуктивного конечных точек. Кроме того, этот анализ полностью присоединяется с государственными приоритетами, выделенных в токсичности в докладе века 21-го 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод, описанный здесь, является первой большой стратегии масштаба для идентификации зародышевой линии токсикантов. Это требует использования в GFP трансгенных Pxol-1 :: GFP, содержащий штамм, который верой и правдой сообщает индукцию анеуплоидии у ранних эмбрионов, который использует?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources NIH ES020353 and the Colgate-Palmolive Alternative Research Grant award for making this work possible.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 60mm vented, sharp edge Petri Dishes | Tritech | T3315 | |
| Agar | Apex | 20-274 | |
| Axygen 96 Well Clear Round Bottom 2mL Polypropylene Deep Well Plate | Corning | P-DW-20-C-S | |
| Bactopeptone | Apex | 20-261 | |
| Bacto-tryptone | Fisher Scientific | BP1421-2 | |
| Bleach | Clorox | ||
| Calcium Chloride (CaCl2) | VWR | AA12316-A1 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | ICN10138225 | |
| DMSO | VWR | IC19018680 | |
| E. coli (OP50) | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Ethanol 200 proof | VWR | EM-4455S | |
| Greiner CELLSTAR 384 well plates | Sigma-Aldrich | M1937-32EA | |
| ImageXpress Micro XLS System | Molecular Devices | ||
| Levamisole hydrochloride | Fluka | 31742 | |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | VWR | 97061-438 | |
| MetaXpress High Content Image Acquisition & Analysis Software | Molecular Devices | ||
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Rayon Films for Biological Cultures | VWR | 60941-086 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318 | |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | VWR | BDH0316 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 745 | This microscope has a total magnification form 3.35x to 300x. Any microscope with similar characteristics will work. |
| TY2441 C. elegans, Pxol-1::GFP reporter strain | Caenorhabditis Genetics Center | http://www.cbs.umn.edu/cgc | |
| Yeast extract | Becton Dickinson | 212750 |
References
- Office, U. G. A. Report No. GAO-06-1032T. Actions are needed to improve the effectiveness of EPA’s chemical review program. Testimony before the Committee on Environment and Public Works. US Senate. , (2009).
- Fragouli, E., Wells, D., Delhanty, J. D. Chromosome abnormalities in the human oocyte. Cytogenet Genome Res. 133 (2-4), 107-118 (2011).
- Hassold, T., Hunt, P. A., Sherman, S. Trisomy in humans: incidence, origin and etiology. Curr Opin Genet Dev. 3 (3), 398-403 (1993).
- Heron, M., Hoyert, D. L., Murphy, S. L., Xu, J., Kochanek, K. D., Tejada-Vera, B. Deaths: final data for 2006. Natl Vital Stat Rep. 57 (14), 1-134 (2009).
- Hunt, P. A. Meiosis in mammals: recombination, non-disjunction and the environment. Biochem Soc Trans. 34 (Pt 4), 574-577 (2006).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. 유전학. 77 (1), 71-94 (1974).
- Hodgkin, J., Horvitz, H. R., Brenner, S. . Nondisjunction Mutants of the Nematode CAENORHABDITIS ELEGANS.Genetics. 91 (1), 67-94 (1979).
- Nicoll, M., Akerib, C. C., Meyer, B. J. X-chromosome-counting mechanisms that determine nematode sex. Nature. 388 (6638), 200-204 (1997).
- Kelly, K. O., Dernburg, A. F., Stanfield, G. M., Villeneuve, A. M. Caenorhabditis elegans msh-5 is required for both normal and radiation-induced meiotic crossing over but not for completion of meiosis. 유전학. 156 (2), 617-630 (2000).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A Screening Platform for the Rapid Assessment of Chemical Disruption of Germline Function. Environ Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- National Research Council. . Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy. , (2007).
- Boyd, W. A., Smith, M. V., Kissling, G. E., Freedman, J. H. Medium- and high-throughput screening of neurotoxicants using C. elegans. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 68-73 (2010).
