JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Genetische barcodes met fluorescerende eiwitten voor multiplexverzending Toepassingen

Published: April 14, 2015
doi:
10.3791/52452
, , , , , , ,
1Department of Biology,San Diego State University

Summary

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

Abstract

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded ´indefinitely´. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Introduction

Technologieën zoals fluorescentie spectroscopie, fluorescentie microscopie en flowcytometrie, allemaal afhankelijk van fluorescentie, een woning op grote schaal uitgebuit in biochemische, biomedische en chemische toepassingen. Fluorescentie, hetzij intrinsiek of door etikettering, is benut voor de analyse van eiwit expressie en profielen lot van de cel, eiwit interacties en biologische functies 1-9, en door fluorescentie / Förster resonantie energieoverbrenging voor de detectie van biomoleculen interacties en conformationele veranderingen 10-13. Aangezien de isolatie van het Aequorea victoria groen fluorescerend eiwit (GFP) 14, de ontdekking van nature voorkomende fluorescerende eiwitten van andere cnidarians, vooral koralen, sterk toegenomen het aantal bestaande fluorescerende eiwitten met onderscheiden excitatie / emissie spectra. Deze, samen met de introductie van mutaties in de genen 15-19, have verder uitgebreid de mogelijkheden, het verkrijgen van een ware palet van fluorescente proteïnen beschikbaar voor wetenschappers die microscopie benutten flowcytometrie andere fluorescentie gebaseerde technologieën voor hun onderzoek.

Daarnaast hoewel onafhankelijk de ontwikkeling van retrovirale technologie drastisch vergemakkelijkt de stabiele expressie van ectopische genetische informatie in zoogdiercellen 20-23. Het is dus niet verwonderlijk dat deze technologie is gebruikt om genen van fluorescerende eiwitten over in een groot aantal celtypen en weefsels 24-28 of voor de productie van transgene dieren 29-31. Na de aard van retrovirussen, wordt de genetische informatie van het ectopische fluorescerend eiwit geïntroduceerd in het genoom van de cel 32 en de cel wordt fluorescente 'voor ever'. Deze woning is toegestaan ​​volgen van lot van de cel, of van een enkele cel binnen een populatie van cellen. De nu fluorescerende cel heeft dus Acquired eigen Biosignatuur en kan worden gedefinieerd als barcode. Zijn unieke Biosignatuur identificeert zich van andere cellen, en belangrijker nog, onderscheidt het zich van cellen genetisch gemanipuleerd om verschillende fluorescerende eiwitten met onderscheiden absorptie / emissie spectra te uiten. Biologische toepassingen zoals het volgen van herprogrammering factoren naar pluripotentie 33, de analyse van subnucleaire factoren voor de opheldering van nucleolaire lokalisatie 34, de constructie van fluorescerende reporter plasmiden voor transcriptionele studies 35 of de genetische kenmerken van neuronen voor de studie van neuronale netwerkarchitectuur 36 , zijn slechts vier voorbeelden van de vele die verschillende fluorescent proteïne genen benut voor dezelfde experimentele opstelling.

Flowcytometrie ruim is toegepast voor de analyse van biologische processen op enkele cel niveau, zoals genexpressie, celcyclus, apoptose en signalering door fosforylatie 37-43 .De stabiele expressie van fluorescent proteïne genen in zoogdiercellen is verder versterkt het nut van flowcytometrie voor celanalyse 38,44 en ligand-receptor interacties 45. Verbeterde mogelijkheden hebben stroom toegestaan ​​cytometrie een veel gebruikt methodologie voor high-throughput en high content 46 geworden. Ondanks het nu uitgebreid aantal fluorometers en robotica technologieën die paar plaatafleesinrichting systemen, beeldvorming en kan flowcytometrie, lijkt er een gebrek in de experimentele ontwerp dat kan benutten en past deze verbeterde technologische mogelijkheden zijn.

Snel, betrouwbaar, eenvoudig en robuust cellen gebaseerde methoden zijn drastisch nodig voor multiplex-toepassingen die verder te verbeteren high-throughput capaciteit. Dit geldt vooral op het gebied van geneesmiddelen waarbij techniek celgebaseerde proeven in een gemultiplexte vorm het vermogen van high-throughput screening 39,47-50 kan verbeteren </sup>. Multiplexing, omdat maakt gelijktijdige analyses in een monster, verder verbetert high-throughput mogelijkheden 51-54. Fluorescerende genetische barcoding maakt niet alleen voor elegante multiplexing, maar ook, zij eenmaal, omzeilt de noodzaak van tijdrovende protocollen, verlaagt de kosten gepaard met antilichamen, kralen en vlekken 39,52,55, en kan het aantal schermen die nodig is voor high verminderen throughput toepassingen. We hebben recent beschreven hoe retrovirale technologie multiplexen via fluorescent genetische barcode verbeteren voor biologische toepassingen, door expressie een assay die eerder HIV-1 protease-activiteit 56,57 monitor met verschillende klinisch voorkomende varianten 58. De methodologie wordt toegelicht in een meer beschrijvende manier te focussen op hoe om te selecteren en te versterken genetisch fluorescerende barcode cellen en hoe panelen van klonale populaties uiten verschillende fluorescerende eiwitten en / of verschillende fluorescentie intensit producerenies. Panelen van celpopulaties onderscheiden op basis van hun fluorescerende eigenschappen verbeteren gemultiplexte vermogens, die verder in combinatie kunnen worden benut met celgebaseerde proeven die verschillende biologische vragen pakken. Het protocol beschrijft ook hoe je een panel van barcode cellen die één van de cel-gebaseerde testen die eerder ontwikkeld in het laboratorium ingenieur, zoals bijvoorbeeld 59. Dit protocol is dus niet bedoeld om de gevestigde retrovirale / lentivirale technologie voor genetische overdracht, de waarde van fluorescerende eiwitten of de toepassing van flowcytometrie 60,48 laten maar om het versterkende kracht van het combineren van de drie voor gemultiplexte aanvragen blijkt.

Protocol

1. Voorbereiding van zoogdiercellen, Viral Productie en Transduction voor Genetische barcodes Plaat 2,5 x 10 6 hechtende cellen in een 10 cm plaat (of ongeveer 50-60% confluentie) één dag voor transfectie in Dulbecco's gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) met 10% foetaal kalfsserum (FCS). Voor retrovirale productie gebruik inpakcellijn-lijn van keuze, zoals Phoenix-GP (een soort geschenk van Gary Nolan, Stanford University). OPMERKING: De inpakcellijn stabiel uitdrukt Gag en Pol eiwitten …

Representative Results

Multiplexing fluorescerende genetisch barcode cellen ten behoeve van biologische toepassingen kan alleen worden bereikt wanneer individuele klonale populaties zijn gegenereerd. Multiplexing is het meest effectief wanneer barcode populaties duidelijk te onderscheiden fluorescerende eigenschappen met minimale spectrale overlap. De in figuur 1 met klonale populaties van cellen zoogdiercellen SupT1 voorbeeld illustreert dat barcode cellen met mCherry en cyaan fluorescerend eiwit (CFP) gemakkelijk simultaan …

Discussion

Hier twee goed uitgewerkte procedures zijn gecombineerd; genetische manipulatie door middel van retrovirale technologie en detectie van fluorescerende eiwitten met behulp van flowcytometrie. Fluorescerend eiwit gebaseerde genetische barcode voor de productie van unieke cellijnen verschaft een robuuste en eenvoudige manier voor multiplex toepassingen. Genereren van genetisch gemanipuleerde barcode cellen door retrovirale-technologie, is in eerste instantie een langdurig proces, maar maakt het mogelijk om te verkrijgen, e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij zouden graag Dr Garry Nolan danken aan de Stanford University voor het verstrekken van de Phoenix GP inpakcellijn voor de productie van retrovirale deeltjes. Wij danken Dr Roger Tsien aan de Universiteit van Californië in San Diego voor het verstrekken van td tomaat. We willen ook graag naar de San Diego State University flowcytometrie Core Facility bedanken voor hun service en hulp.

Materials

Name of Material/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
10mL syringes BD   309604 used for filtering the virus
0.45µm plytetrafluoroethylen filter pall corporation 4219 used for filtering the virus
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Corning 45000-304 cell growth media for HEK 293T cells
PEI (Polyethylenimine) poly sciences 23966-2  2mg/mL concentration used
Hanging bucket centrifuge (refrigerated) Eppendorf  5805 000.017 used for spin infection
PBS (phosphate buffered saline) Corning 21-040-CV used for washing of cells
Polybrene (hexadimethreen bromide) Sigma-Aldrich 107689 Used to increase viral infection efficiency.  Used at a 5µg/mL concentration. 
FACSAria BD Biosciences instrument used for sorting cell populations
FACSCanto BD Biosciences instrument used for cell analysis
Phoenix-GP Gift from Gary Nolan cell line used to produced retroviral particles
Fetal calf serum Mediatech MT35015CV  used for cell growth and sorting
 SupT1 cells ATCC CRL-1942 Human T lymphoblasts
HEK 293T cells ATCC CRL-11268 Human Embryonic Kidney cells that also contain the SV40 large T-antigen
RPMI 1640 Corning 10-040-CV cell growth media for SupT1 cells
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression.Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  2. Misteli, T., Caceres, J. F., Spector, D. L. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. Nature. 387 (6632), 523-527 (1997).
  3. Godwin, A. R., Stadler, H. S., Nakamura, K., Capecchi, M. R. Detection of targeted GFP-Hox gene fusions during mouse embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (22), 13042-13047 (1998).
  4. Irish, J. M., et al. Single cell profiling of potentiated phospho-protein networks in cancer cells. Cell. 118 (2), 217-228 (2004).
  5. Natarajan, L., Jackson, B. M., Szyleyko, E., Eisenmann, D. M. Identification of evolutionarily conserved promoter elements and amino acids required for function of the C. elegans beta-catenin homolog BAR-1. Dev Biol. 272 (2), 536-557 (2004).
  6. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin.Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  7. Valencia-Burton, M., et al. Spatiotemporal patterns and transcription kinetics of induced RNA in single bacterial cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16399-16404 (2009).
  8. Mahmoud, L., et al. Green fluorescent protein reporter system with transcriptional sequence heterogeneity for monitoring the interferon response.J Virol. 85 (18), 9268-9275 (2011).
  9. Saunders, M. J., et al. Fluorogen activating proteins in flow cytometry for the study of surface molecules and receptors.Methods. 57 (3), 308-317 (2012).
  10. Wang, Y. L., Taylor, D. L. Probing the dynamic equilibrium of actin polymerization by fluorescence energy transfer. Cell. 27 (3 Pt 2), 429-436 (1981).
  11. He, L., et al. Flow cytometric measurement of fluorescence (Forster) resonance energy transfer from cyan fluorescent protein to yellow fluorescent protein using single-laser excitation at 458 nm. Cytometry A. 53 (1), 39-54 (2003).
  12. Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
  13. Clayton, A. H., et al. Ligand-induced dimer-tetramer transition during the activation of the cell surface epidermal growth factor receptor-A multidimensional microscopy analysis. J Biol Chem. 280 (34), 30392-30399 (2005).
  14. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein.Gene. 111 (2), 229-233 (1992).
  15. Heim, R., Cubitt, A. B., Tsien, R. Y. Improved green fluorescence. Nature. 373 (6516), 663-664 (1995).
  16. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  17. Ai, H. W., Shaner, N. C., Cheng, Z., Tsien, R. Y., Campbell, R. E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins.Biochemistry. 46 (20), 5904-5910 (2007).
  18. Mishin, A. S., et al. The first mutant of the Aequorea victoria green fluorescent protein that forms a red chromophore. 생화학. 47 (16), 4666-4673 (2008).
  19. Tsien, R. Y. Constructing and exploiting the fluorescent protein paintbox (Nobel Lecture). Angew Chem Int Ed Engl. 48 (31), 5612-5626 (2009).
  20. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  21. Klages, N., Zufferey, R., Trono, D. A stable system for the high-titer production of multiply attenuated lentiviral vectors. Mol Ther. 2 (2), 170-176 (2000).
  22. Lai, Z., Brady, R. O. Gene transfer into the central nervous system in vivo using a recombinanat lentivirus vector. J Neurosci Res. 67 (3), 363-371 (2002).
  23. Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol Biol. 246, 391-411 (2004).
  24. Grignani, F., et al. High-efficiency gene transfer and selection of human hematopoietic progenitor cells with a hybrid EBV/retroviral vector expressing the green fluorescence protein. Cancer Res. 58 (1), 14-19 (1998).
  25. Ramezani, A., Hawley, T. S., Hawley, R. G. Lentiviral vectors for enhanced gene expression in human hematopoietic cells. Mol Ther. 2 (5), 458-469 (2000).
  26. Roddie, P. H., Paterson, T., Turner, M. L. Gene transfer to primary acute myeloid leukaemia blasts and myeloid leukaemia cell lines. Cytokines Cell Mol Ther. 6 (3), 127-134 (2000).
  27. Zhang, X. Y., et al. Lentiviral vectors for sustained transgene expression in human bone marrow-derived stromal cells. Mol Ther. 5 (5 Pt 1), 555-565 (2002).
  28. Rossi, G. R., Mautino, M. R., Morgan, R. A. High-efficiency lentiviral vector-mediated gene transfer into murine macrophages and activated splenic B lymphocytes. Hum Gene Ther. 14 (4), 385-391 (2003).
  29. Hamra, F. K., et al. Production of transgenic rats by lentiviral transduction of male germ-line stem cells.Proc. Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14931-14936 (2002).
  30. Chan, A. W., Chong, K. Y., Martinovich, C., Simerly, C., Schatten, G. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes. Science. 291 (5502), 309-3012 (2001).
  31. Linney, E., Hardison, N. L., Lonze, B. E., Lyons, S., DiNapoli, L. Transgene expression in zebrafish: A comparison of retroviral-vector and DNA-injection approaches. Dev Biol. 213 (1), 207-2016 (1999).
  32. Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).
  33. Tiemann, U., et al. Optimal reprogramming factor stoichiometry increases colony numbers and affects molecular characteristics of murine induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 79 (6), 426-435 (2011).
  34. Leung, A. K., Lamond, A. I. In vivo analysis of NHPX reveals a novel nucleolar localization pathway involving a transient accumulation in splicing speckles. J Cell Biol. 157 (4), 615-629 (2002).
  35. Malone, C. L., et al. Fluorescent reporters for Staphylococcus aureus. J Microbiol Methods. 77 (3), 251-260 (2009).
  36. Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
  37. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single cell signaling events. Cytometry A. 55 (2), 61-70 (2003).
  38. Violin, J. D., Zhang, J., Tsien, R. Y., Newton, A. C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase. C.J Cell Biol. 161 (5), 899-909 (2003).
  39. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3 (5), 361-368 (2006).
  40. Edwards, B. S., Ivnitski-Steele, I., Young, S. M., Salas, V. M., Sklar, L. A. High-throughput cytotoxicity screening by propidium iodide staining. Curr Protoc Cytomt. 9 (Unit 9 24), (2007).
  41. Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. 8 (Unit 8 17), (2007).
  42. Lu, R., Neff, N. F., Quake, S. R., Weissman, I. L. Tracking single hematopoietic stem cells in vivo using high-throughput sequencing in conjunction with viral genetic barcoding. Nat Biotechnol. 29 (10), 928-933 (2011).
  43. Grant, G. D., et al. Live-cell monitoring of periodic gene expression in synchronous human cells identifies Forkhead genes involved in cell cycle control. Mol Biol Cell. 23 (16), 3079-3093 (2012).
  44. Fiering, S. N., et al. Improved FACS-Gal: flow cytometric analysis and sorting of viable eukaryotic cells expressing reporter gene constructs. Cytometry. 12 (4), 291-301 (1991).
  45. Fay, S. P., Posner, R. G., Swann, W. N., Sklar, L. A. Real-time analysis of the assembly of ligand, receptor, and G protein by quantitative fluorescence flow cytometry. 생화학. 30 (20), 5066-5075 (1991).
  46. Edwards, B. S., Oprea, T., Prossnitz, E. R., Sklar, L. A. Flow cytometry for high-throughput, high-content screening. Curr Opin Chem Biol. 8 (4), 392-398 (2004).
  47. Durick, K., Negulescu, P. Cellular biosensors for drug discovery. Biosens Bioelectron. 16 (7-8), 587-592 (2001).
  48. Edwards, B. S., et al. High-throughput flow cytometry for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 2 (5), 685-696 (2007).
  49. Sklar, L. A., Carter, M. B., Edwards, B. S. Flow cytometry for drug discovery, receptor pharmacology and high-throughput screening. Curr Opin Pharmacol. 7 (5), 527-534 (2007).
  50. Curpan, R. F., et al. High-throughput screen for the chemical inhibitors of antiapoptotic bcl-2 family proteins by multiplex flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 465-474 (2011).
  51. Bradford, J. A., Buller, G., Suter, M., Ignatius, M., Beechem, J. M. Fluorescence-intensity multiplexing: simultaneous seven-marker, two-color immunophenotyping using flow cytometry. Cytometry A. 61 (2), 142-152 (2004).
  52. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Trejo, A., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding for multiplex flow cytometry. Curr Protoc Cytom. 6 (Unit 6 31), (2011).
  53. Surviladze, Z., Young, S. M., Sklar, L. A. High-throughput flow cytometry bead-based multiplex assay for identification of Rho GTPase inhibitors. Methods Mol Biol. 827, 253-270 (2012).
  54. Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PLoS One. 8 (1), e53015 (2013).
  55. Vignali, D. A. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J Immunol Methods. 342 (1-2), 243-255 (2000).
  56. Hilton, B. J., Wolkowicz, R. An assay to monitor HIV-1 protease activity for the identification of novel inhibitors in T-cells. PLoS One. 5 (6), e10940 (2010).
  57. Rajakuberan, C., Hilton, B. J., Wolkowicz, R. Protocol for a mammalian cell-based assay for monitoring the HIV-1 protease activity. Methods Mol Biol. 903, 393-405 (2012).
  58. Smurthwaite, C. A., et al. Fluorescent genetic barcoding in mammalian cells for enhanced multiplexing capabilities in flow cytometry. Cytometry A. 85 (1), 105-113 (2014).
  59. Stolp, Z. D., et al. A Novel Two-Tag System for Monitoring Transport and Cleavage through the Classical Secretory Pathway – Adaptation to HIV Envelope Processing. PLoS One. 8 (6), e68835 (2013).
  60. Schwartz, A., et al. Standardizing flow cytometry: a classification system of fluorescence standards used for flow cytometry. Cytometry. 33 (2), 106-114 (1998).

Tags

Genetic BarcodingFluorescent ProteinsMultiplexed ApplicationsMolecular Cell BiologyRetroviral TechnologyCell TrackingCell PopulationsBiosignatureCell-based AssaysMultiplexing
check_url/kr/52452?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Smurthwaite, C. A., Williams, W., Fetsko, A., Abbadessa, D., Stolp, Z. D., Reed, C. W., Dharmawan, A., Wolkowicz, R. Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications. J. Vis. Exp. (98), e52452, doi:10.3791/52452 (2015).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image