توصيف وظيفي نا<sup> +</sup> / H<sup> +</sup> المبادلات بين الخلايا من المقصورات عن طريق بروتون-مما أسفر عن مقتل اختيار للتعبير عنها في غشاء البلازما
Summary
The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.
Abstract
تحمض Endosomal أمر بالغ الأهمية لمجموعة واسعة من العمليات، مثل إعادة التدوير البروتين وتدهور، مستقبلات الحساسية، وناقل عصبي تحميل في الحويصلات المشبكية. يتم وصف هذا تحمض أن بوساطة ATPases بروتون، بالإضافة إلى النقل كلوريد CLC. غاية الحفاظ-البروتونات النقل electroneutral، وأعرب نا + / H + المبادلات (NHE) 6 و 7 و 9 أيضا في هذه المقصورات. وقد تم ربط الطفرات في الجينات مع الأمراض المعرفية والعصبية البشرية. ومن المفارقات، تظل أدوارهم بعيد المنال، وتوطين لهم داخل الخلايا منعت توصيف وظيفي مفصل. وتظهر هذه المخطوطة طريقة لحل هذه المشكلة. هذا يتكون من مجموعة من خطوط الخلايا الطافرة، قادرة على قيد الحياة تحمض عصاري خلوي الحاد من خلال الاحتفاظ NHEs داخل الخلايا في الغشاء البلازمي. ثم يصور اثنين من البروتوكولات المكملة لقياس الانتقائية أيون والنشاطهذه المبادلات: (ط) واحدة على أساس قياسات درجة الحموضة داخل الخلايا باستخدام المجهر مضان الفيديو، و (ثانيا) واحدة على أساس حركية سريعة الامتصاص الليثيوم. هذه البروتوكولات يمكن استقراء لقياس غيرها من شركات النقل غير كهربي. وعلاوة على ذلك، فإن الإجراء اختيار المعروضة هنا يولد خلايا مع الاحتفاظ النمط الظاهري خلل داخل الخلايا. لذلك هذه الخلايا سوف التعبير عن الأخرى أيضا بروتينات الغشاء الحويصلي على غشاء البلازما. ولذلك فإن استراتيجية التجريبية يصور هنا تشكل أداة قوية محتملة لدراسة البروتينات داخل الخلايا الأخرى التي سيتم ثم أعرب عنها في غشاء البلازما جنبا إلى جنب مع حويصلي نا + / H + المبادلات المستخدمة في اختيار.
Introduction
عرض معظم مقصورات درجة الحموضة داخل الخلايا اللمعية الحمضية، وهي معلمة رئيسية للنضوج، والاتجار، وإعادة التدوير من البروتينات أو الهرمونات والناقلات العصبية تحميل. وقد تبين أن يتم إنشاء التدرج درجة الحموضة بين العصارة الخلوية والحويصلي المحتوى من قبل فجوي H + ATPases 1، بالإضافة إلى حويصلي النقل كلوريد CLC 2. سواء في طرق المغادرة (KO) الفئران والمرضى من البشر، وقد تم تسليط الضوء على أهمية هذه الناقلين من الظواهر الثقيلة التي تسببها طفرات في جيناتها 3-6.
ووصف أعضاء المبادلات الصوديوم والهيدروجين SLC9A الأسرة، وكذلك NHEs لنا + / H + المبادلات، وقد ثبت أن تكون المؤثرات الرئيسية في درجة الحموضة داخل الخلايا وتنظيم حجم الخلية، وكذلك في نقل اتجاهي من مكافئات الحمضي القاعدي عبر الظهارة . إلى جانب NHEs غشاء البلازما، وثلاثة حفظا للغاية نا + / H + المبادلات، NHE 6 و 7ويتم التعبير عن 9 في شبكة عابرة للجولجي والإندوسومات في وقت مبكر (7). وقد تم ربط الطفرات في الجينات مع Angelman تشبه أو كرستيانسون المتلازمات 8-9 والتوحد القائم على الأسرة 10 ونقص الانتباه فرط النشاط اضطراب 11-12. كما شاركت هذه المبادلات في المشاكل العصبية مثل مرض الزهايمر القابلية 13 و X-ربط التخلف العقلي الجينات متجاورة متلازمات 14. أخذت معا، وتبرز هذه الدراسات على أهمية هذه NHEs داخل الخلايا في نمو الدماغ و / أو وظيفة.
توطين الخلايا من هذه المبادلات يمنع قياسات دقيقة من الانتقائية أيون، والاتجاه النقل والمعلمات الحركية، والتنظيم. كما هو الحال بالنسبة لجميع الناقلين أعرب في المقصورات داخل الخلايا، فإنه من الصعب للغاية لتقييم أنشطتها الحيوية، وبالتالي التوصل إلى فهم كامل أدوارهم الفسيولوجية وميكانالمذهبين الكامنة آثارها المرضية. وبناء على عصاري خلوي تركيز K + عالية، وكانت الفرضية الأكثر شيوعا قبلت أن كانوا يعملون كما K + جانب بروتون النقل هروب رأس المال. وكان وجود مثل تسرب بروتون تم الافتراض، لأنها قد موازنة بروتون ضخ من قبل V-ATPases من أجل الحفاظ على حالة الاستقرار حويصلي درجة الحموضة. والهدف من هذه المادة هو البصرية (ط) ليبرهن على وجود طريقة التي تسمح للاختيار الوراثية من خطوط الخلايا التي تعبر عن هذه الناقلين حويصلي في غشاء البلازما الخاصة بهم، و (ثانيا) لإظهار نهجين مستقلة لقياس وظائف هذه الناقلين.
قبل ثلاثة عقود، Pouysségur وفرانكي كان لها السبق في نهج الجيني التي مكنت الاستنساخ الجزيئي وتوصيف أعضاء الأسرة NHE 15. وقد استند هذا على سمية البروتونات داخل الخلايا كوسيلة من وسائل الفحص. وكانت الخطوة الأولى للحصول على خطوط الخلايا ناقصةفي أي نا + / H + الصرف التي أعرب عنها في غشاء البلازما، وذلك باستخدام عكس هذا الناقل. تم مسبقة الخلايا الليفية (CCL39 خط خلية) مع نا + أو لي + ثم توضع في وسيلة خارج الخلية الحمضية (الرقم الهيدروجيني 6.5) لمدة 2 ساعة. وأدى ذلك إلى موت خلايا تعبر عن وظيفي نا + / H + الصرف واختيار خلايا antiporter ناقص (PS120 خط الخلية) 16. عندما يزرع في خالية من بيكربونات المتوسطة، وهذه الخلايا هي حساسة جدا لتحمض داخل الخلايا الحاد. ونتيجة لذلك، وسيتم اختيار التعبير عن أي آلية بروتون هروب رأس المال وظيفية في غشاء البلازما إيجابيا (انظر 17) إذا قدمت مثل هذه الخلايا إلى داخل الخلايا acidifications الحادة. تقنيات تحمض مثل هذه يمكن استخدامها لعزل خطوط الخلايا مع الاتجار العيوب تمكين التعبير القسري للNHEs داخل الخلايا WT على غشاء البلازما.
كما حقيقية النواة نا + / H+ المبادلات هي electroneutral، فهي ليست قابلة للقياس من قبل النهج الكهربية التي استخدمت مع النجاح الكبير لقياس القنوات. لذا يوضح هذا المخطوط كيفية قياس نشاط هذا مبادل من قياسات درجة الحموضة داخل الخلايا وحركية السريع لامتصاص الليثيوم. كما المفاهيم الأساسية هي نفسها، ومن المثير للاهتمام أن نلاحظ أن العديد من العمليات التي وضعت لاختيار القسم تستخدم أيضا بشكل مباشر عن القياسات الوظيفية.
ومن المثير للاهتمام، لاحظنا أن العيب الاتجار الحالي في خطوط الخلية المحددة باستخدام النهج الوارد وصفها في هذه المخطوطة يؤدي إلى التعبير أكبر من البروتينات حويصلي أخرى في غشاء البلازما مثل قناة البوتاسيوم حويصلي TWIK1 18. وهذا يشير إلى نحو اختيار آلية عيب الاحتفاظ العامة للبروتينات الغشاء حويصلي. وبالتالي هذا الإجراء الاختيار وخلايا أنه يولد مايوتشكل أداة واعدة بالنسبة للمجتمع العلمي تعمل على بروتينات الغشاء من المقصورات داخل الخلايا. وكذلك تقنيات قياس المقدمة هنا قد تكون قابلة للتطبيق لدراسة أخرى الناقلين غير كهربي.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول وكيفية اختيار الخلايا معربا داخل الخلايا نا + / H + المبادلات في غشاء البلازما دون تغيير تسلسل الأساسي من خلال الطفرات موقع الموجه. ويمكن الآن أن تتسم هذه المبادلات.
ويستند هذا الأسلوب على سمية الخلوي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouysségur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10X | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
References
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters. J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).
- Kornak, U., et al. Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis. Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).
- Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. The ClC-5 chloride channel knock-out mouse – an animal model for Dent’s disease. Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).
- Kasper, D., et al. Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration. Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).
- Poet, M., et al. Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).
- Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation. J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).
- Gilfillan, G. D., et al. SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).
- Mignot, C., et al. Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum. Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).
- Morrow, E. M., et al. Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry. Science. 321 (5886), 218-223 (2008).
- Lasky-Su, J., et al. Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).
- Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. Genome-wide association studies in ADHD. Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).
- Meda, S. A., et al. A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer’s disease in the ADNI cohort. Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).
- Zhang, L., et al. A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred. Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).
- Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter. Cell. 56 (2), 271-280 (1989).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L’Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter. J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).
- Milosavljevic, N., et al. The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis. Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).
- Wigler, M., et al. Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes. Cell. 16 (4), 777-785 (1979).
- Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens. EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).
- Milosavljevic, N., et al. Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling. Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).
- Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells. Nature. 325, 447-450 (1987).
- Quentin, F., et al. RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron. J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).
- Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).
