Caracterización funcional de Na<sup> +</sup> / H<sup> +</sup> Intercambiadores de compartimentos intracelular usando selección Protón-matanza para expresarlos a la membrana plasmática
Summary
The first part of this article shows how to select mutant cell lines expressing vesicular Na+/H+ exchangers at their plasma membrane. The second part provides protocols based on intracellular pH measurements and fast ion uptake, which are used to determine the ion selectivity and the kinetic parameters of these exchangers.
Abstract
La acidificación endosomal es crítica para una amplia gama de procesos, como el reciclaje de proteínas y la degradación, la desensibilización del receptor y neurotransmisor de carga en las vesículas sinápticas. Esta acidificación se describe estar mediado por ATPasas de protones, junto a los transportadores de cloruro ClC. Altamente conservadas protones electroneutral transportadores, la Na + / H + (NHE) intercambiadores de 6, 7 y 9 también se expresan en estos compartimentos. Las mutaciones en sus genes se han relacionado con enfermedades cognitivas y neurodegenerativas humanas. Paradójicamente, su papel sigue siendo difícil, ya que su localización intracelular ha impedido caracterización funcional detallada. Este manuscrito muestra un método para resolver este problema. Esta consiste en la selección de líneas celulares mutantes, capaces de sobrevivir a la acidificación citosólica aguda mediante la retención de NHEs intracelulares a la membrana plasmática. A continuación, representa dos protocolos complementarios para medir la selectividad y actividad de los ionesde estos intercambiadores de: (i) uno en base a mediciones de pH intracelulares mediante microscopía de fluorescencia de vídeo, y (ii) uno basado en la cinética rápida de la absorción de litio. Estos protocolos pueden ser extrapolados a medir otros transportistas no electrógenos. Además, el procedimiento de selección que aquí se presenta genera células con un fenotipo defectuoso retención intracelular. Por lo tanto estas células también expresar otras proteínas de membrana vesicular en la membrana plasmática. Por consiguiente, la estrategia experimental representado aquí puede constituir una herramienta potencialmente potente para estudiar otras proteínas intracelulares que se expresan a continuación en la membrana plasmática junto con el vesicular Na + / H + intercambiadores utilizados para la selección.
Introduction
La mayoría de los compartimentos intracelulares muestran un pH luminal ácida, que es un parámetro clave para la maduración, el tráfico, el reciclaje de las proteínas u hormonas y neurotransmisores de carga. Se ha demostrado que el gradiente de pH entre el citosol y vesicular contenido es generado por vacuolar H + ATPasas 1, acoplado a los transportadores vesiculares de cloruro ClC 2. Tanto en ratones knock-out (KO) y los pacientes humanos, la importancia de estos transportadores ha sido destacada por los fenotipos pesados causadas por mutaciones en sus genes 3-6.
Los miembros de la familia SLC9A intercambiadores de sodio-hidrógeno, también denominado NHEs de Na + / H + intercambiadores, han mostrado ser efectores clave en el pH intracelular y la regulación del volumen celular, así como en el transporte vectorial de equivalentes de ácido-base través de los epitelios . Además de los NHEs de la membrana plasmática, tres altamente conservadas Na + / H + intercambiadores, NHE 6, 7y 9 se expresan en la red trans-Golgi y en los endosomas tempranos 7. Las mutaciones en sus genes se han relacionado con Angelman similar o Christianson Síndromes 8-9, basado en la familia autismo 10 y Déficit de Atención e Hiperactividad 11-12. Estos intercambiadores también han estado involucrados en problemas neurodegenerativos como el Alzheimer y la susceptibilidad a la enfermedad 13 genes contiguos retraso mental ligado al cromosoma X síndromes 14. En conjunto, estos estudios ponen de relieve la importancia de estos NHEs intracelulares en el desarrollo y / o la función cerebral.
La localización intracelular de estos intercambiadores impide mediciones precisas de su selectividad de iones, dirección de transporte, parámetros cinéticos, y la regulación. Como es el caso para todos los transportadores expresados en compartimentos intracelulares, es extremadamente difícil de evaluar sus actividades bioquímicas y por lo tanto para comprender plenamente sus funciones fisiológicas y la mechanismos subyacente sus implicaciones patológicas. En base a la alta concentración citosólica K +, la hipótesis más comúnmente aceptada era que estaban trabajando como K +, junto transportadores de salida de protones. La existencia de una fuga de protones tales había planteado la hipótesis, ya que puede contrarrestar de bombeo de protones por las V-ATPasas con el fin de mantener un pH constante vesicular estado. El objetivo de este artículo es visual (i) para demostrar un método que permite la selección genética de líneas celulares que expresan tales transportadores vesiculares en su membrana plasmática, y (ii) para mostrar dos enfoques independientes para medir las funciones de estos transportadores.
Hace tres décadas, Pouysségur y Franchi han sido pioneros en un enfoque genético que permitió la clonación molecular y caracterización de los miembros de la familia NHE 15. Esto se basó en la toxicidad de protones intracelulares como un método de cribado. El primer paso fue obtener líneas celulares deficientesen cualquier / H + intercambio Na + expresado en la membrana plasmática, utilizando la reversibilidad de este transportador. Los fibroblastos (línea de células CCL39) se precargados con Na + o Li + y luego se colocan en un medio extracelular ácido (pH 6,5) durante 2 horas. Esto condujo a la muerte de las células que expresan un funcional Na + / H + de cambio y para la selección de células-antiporter deficiente (línea celular PS120) 16. Cuando se cultiva en un medio libre de bicarbonato, estas células son muy sensibles a la acidificación intracelular aguda. En consecuencia, se seleccionará positivamente la expresión de cualquier mecanismo de eflujo de protones funcional en la membrana plasmática (véase 17), si dichas células se someten a acidificación intracelular agudas. Tales técnicas de acidificación pueden ser utilizados para aislar líneas celulares con el tráfico de defectos que permiten la expresión forzada de NHEs intracelulares WT en la membrana plasmática.
Como eucariota Na + / H+ Intercambiadores son electroneutral, que no son mensurables por los métodos electrofisiológicos que se han utilizado con gran éxito para medir canales. Por tanto, este manuscrito demuestra cómo medir la actividad de este intercambiador por mediciones de pH intracelular y cinética rápida de la absorción de litio. Como los conceptos subyacentes son los mismos, es interesante notar que muchos de los procesos desarrollados para la sección de selección también se utilizan directamente para las mediciones funcionales.
Curiosamente, hemos observado que el defecto tráfico presente en las líneas celulares seleccionadas usando el enfoque descrito en este manuscrito conduce a una mayor expresión de otras proteínas vesiculares en la membrana plasmática, tales como el canal de potasio vesicular TWIK1 18. Esto señala hacia la selección de un mecanismo general defecto de retención para proteínas transmembrana vesiculares. Por lo tanto este procedimiento de selección y las células que genera mayoconstituyen una herramienta prometedora para la comunidad científica que trabaja en las proteínas de la membrana de los compartimentos intracelulares. Además de las técnicas de medición presentados aquí podrían ser aplicables para el estudio de otros transportistas no electrógenos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe cómo seleccionar las células que expresan intracelular de Na + / H + intercambiadores en la membrana plasmática sin alterar su secuencia primaria por mutagénesis dirigida al sitio. Estos intercambiadores de ahora se pueden caracterizar.
Este método se basa en la toxicidad celular de protones intracelulares para seleccionar líneas celulares que expresarán vesicular Na + / H + intercambiadores en la membrana plasmática…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are deeply indebted to all the members of the scientific community working on pH and ion transport, who have originated and improved the measurements described here. They particularly thank Dr. Jacques Pouysségur who originated the H+-killing selection technique used here. They acknowledge the University of Nice-Sophia Antipolis, the CNRS, the ANR (JCJC SVSE1 NHEint) and the ICST Labex for support.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Standard cell culture equipement | Used for H+ killing selection composed of many devices with different catalog numbers | ||
| Incubator with CO2 | Sanyo | MCO15A | |
| Incubator without CO2 | Heraeus instrument | BB6220 | |
| Laminar flow hood PSM1200NF | Fisher | 52010120 | |
| DMEM medium | sigma | D5796 | |
| FBS gold | GE Healthcare | A15-151 | |
| Penicilin/streptomycin | PAA | P11-010 | |
| Trypsin 10X | PAA | L11-003 | |
| Atomic Absorption spectrometer with Zeeman furnace system | Thermo Scientific | ICE 3500 GFZ | |
| LiCl | sigma | L4408 | |
| Nitric Acid | sigma | 438073 | |
| Fluorescence videomicroscopy set | Leica | Composed of many devices with different catalog numbers | |
| Inverted automated microscope | Leica | DMI6000B | |
| microscope stand | leica | 11888906 | |
| 11888911 | |||
| 11505180 | |||
| 11888377 | |||
| incident fluorescence | leica | 11888901 | |
| 11504166 | |||
| motor bracket | leica | 11888379 | |
| 11505234 | |||
| 11521505 | |||
| 11522106 | |||
| LED transmission light | leica | 8097321 | |
| 8102034 | |||
| 11521580 | |||
| motorized plate | leica | 11522068 | |
| 11531172 | |||
| 11521734 | |||
| 11521719 | |||
| 11888423 | |||
| 11888424 | |||
| camera output | leica | 11888373 | |
| 11507807 | |||
| 11888393 | |||
| 11888259 | |||
| 11888258 | |||
| 11541510 | |||
| images acquisition/analysis software | leica | 11888375 | |
| optics | leica | 11506507 | |
| 11506243 | |||
| 11506203 | |||
| fluorescence Xenon lamp | leica | DMI6000 | |
| camera | hamamatsu | 8100601 | |
| metafluor/Mmfluor software | 11640905 | ||
| pH sensitive probe, BCECF-AM | life technologies | B1170 | |
| Nigericin | Sigma | N7143 |
References
- Marshansky, V., Futai, M. The V-type H+-ATPase in vesicular trafficking: targeting, regulation and function. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 415-426 (2008).
- Jentsch, T. J. Chloride and the endosomal-lysosomal pathway: emerging roles of CLC chloride transporters. J Physiol. 578 (3), 633-640 (2007).
- Kornak, U., et al. Mutations in the a3 subunit of the vacuolar H(+)-ATPase cause infantile malignant osteopetrosis. Hum Mol Genet. 9 (13), 2059-2063 (2000).
- Gunther, W., Piwon, N., Jentsch, T. J. The ClC-5 chloride channel knock-out mouse – an animal model for Dent’s disease. Pflugers Arch. 445 (4), 456-462 (2003).
- Kasper, D., et al. Loss of the chloride channel ClC-7 leads to lysosomal storage disease and neurodegeneration. Embo J. 24 (5), 1079-1091 (2005).
- Poet, M., et al. Lysosomal storage disease upon disruption of the neuronal chloride transport protein ClC-6. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (37), 13854-13859 (2006).
- Nakamura, N., Tanaka, S., Teko, Y., Mitsui, K., Kanazawa, H. Four Na+/H+ exchanger isoforms are distributed to Golgi and post-Golgi compartments and are involved in organelle pH regulation. J Biol Chem. 280 (2), 1561-1572 (2005).
- Gilfillan, G. D., et al. SLC9A6 mutations cause X-linked mental retardation, microcephaly, epilepsy, and ataxia, a phenotype mimicking Angelman syndrome. Am J Hum Genet. 82 (4), 1003-1010 (2008).
- Mignot, C., et al. Novel mutation in SLC9A6 gene in a patient with Christianson syndrome and retinitis pigmentosum. Brain & Development. 35 (2), 172-176 (2013).
- Morrow, E. M., et al. Identifying autism loci and genes by tracing recent shared ancestry. Science. 321 (5886), 218-223 (2008).
- Lasky-Su, J., et al. Genome-wide association scan of the time to onset of attention deficit hyperactivity disorder. Am J Med Genet B Neuropsychiatr Genet. 147B (8), 1355-1358 (2008).
- Franke, B., Neale, B. M., Faraone, S. V. Genome-wide association studies in ADHD. Hum Genet. 126 (1), 13-50 (2009).
- Meda, S. A., et al. A large scale multivariate parallel ICA method reveals novel imaging-genetic relationships for Alzheimer’s disease in the ADNI cohort. Neuroimage. 60 (3), 1608-1621 (2012).
- Zhang, L., et al. A microdeletion in Xp11.3 accounts for co-segregation of retinitis pigmentosa and mental retardation in a large kindred. Am J Med Genet A. 140 (4), 349-357 (2006).
- Sardet, C., Franchi, A., Pouysségur, J. Molecular cloning, primary structure, and expression of the human growth factor-activatable Na+/H+ antiporter. Cell. 56 (2), 271-280 (1989).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L’Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Franchi, A., Cragoe, E., Pouysségur, J. Isolation and properties of fibroblast mutants overexpressing an altered Na+/H+ antiporter. J Biol Chem. 261 (31), 14614-14620 (1986).
- Milosavljevic, N., et al. The Intracellular Na+/H+ Exchanger NHE7 effects a Na+ coupled, but not K+ coupled proton-loading mechanism in endocytosis. Cell Reports. 7 (3), 1-8 (2014).
- Wigler, M., et al. Transformation of mammalian cells with genes from procaryotes and eucaryotes. Cell. 16 (4), 777-785 (1979).
- Lacroix, J., Poët, M., Maherel, C., Counillon, L. A mechanism for the activation of the Na/H exchanger NHE-1 by cytoplasmic acidification and mitogens. EMBO Reports. 5 (1), 91-96 (2004).
- Milosavljevic, N., et al. Nongenomic Effects of Cisplatin: Acute Inhibition of Mechanosensitive Transporters and Channels without Actin Remodeling. Cancer Res. 70 (19), 7514-7522 (2010).
- Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Na+-H+ exchange in gastric glands as measured with a cytoplasmic-trapped, fluorescent pH indicator. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (23), 7436-7440 (1984).
- Paradiso, A. M., Tsien, R. Y., Machen, T. E. Digital image processing of intracellular pH in gastric oxyntic and chief cells. Nature. 325, 447-450 (1987).
- Quentin, F., et al. RhBG and RhCG, the putative ammonia transporters, are expressed in the same cells in the distal nephron. J Am Soc Nephrol. 14 (3), 545-554 (2003).
- Geyer, R. R., Musa-Aziz, R., Enkavi, G., Mahinthichaichan, P., Tajkhorshid, E., Boron, W. F. Movement of NH3 through the human urea transporter B: a new gas channel. Am J Physiol Renal Physiol. 304 (12), F1447-F1457 (2013).
