Малый объем биопроб для оценки бактериального / фитопланктона Сотрудничество культуры с использованием воды, импульсно-модулированные по амплитуде (вода-PAM) флюорометрия
Summary
The goal of this procedure is to demonstrate the reproducibility and adaptability of using a microtiter plate format for microalgal screening. This rapid screen combines WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) fluorometry to measure photosynthetic yield as an indicator of Photosystem II (PSII) health with small volume bacterial-algal co-cultures.
Abstract
Обычные методы экспериментальной манипуляции микроводорослей использовали большие объемы культуры (20 мл до 5 л), так что культура может быть половинной дискретизации в течение всего эксперимента 1-7. Подвыборка больших объемов может быть проблематичным по нескольким причинам: 1) он вызывает изменение общего объема и площади поверхности: объемное соотношение культуры в ходе эксперимента; 2) псевдо-репликации (то есть, повторить образцы из той же лечения колбу 8) часто используется вместо истинных дубликатов (то есть, отбора проб из повторных процедур); 3) продолжительность эксперимента ограничена общего объема; и 4) аксенными культуры или обычный бактериальный микрофлора трудно поддерживать во время длительных экспериментов, загрязнение обычно происходит во время подвыборки.
Использование микротитровальных планшетах позволяет 1 тома мл культуры, который будет использоваться для каждого повторить, причем до 48 отдельных процедур в рамках12.65 х 8.5 х 2.2 см тарелка, тем самым уменьшая экспериментальном объеме и позволяет для широкого тиражирования без подвыборки какого-либо лечения. Кроме того, этот метод может быть изменен, чтобы соответствовать различные экспериментальных форматов, включая: бактериально-водорослевые сокультурах, водорослей физиологии испытаний, и токсин скрининга 9-11. Индивидуальные скважины со водоросли, бактерии и / или сопутствующих культур можно попробовать для многочисленных лабораторных процедур, включая, но не ограничиваясь: вода-амплитудно-импульсной модуляцией (водно-PAM) флюометрия, микроскопия, бактериальный колониеобразующих единица (КОЕ) графы и проточной цитометрии. Сочетание формате микропланшетный и водно-PAM флуорометрии позволяет несколько быстрых измерений фотохимического выхода и других фотохимических параметров с низкой изменчивости между образцами, высокой воспроизводимости и избежать многих подводных камней подвыборки в бутыль или коническую колбу в течение эксперимента ,
Introduction
Фитопланктон физиология традиционно изучались в мезо-масштабных экспериментов, начиная от 20 мл в конические колбы до 5 л в бутылях 1-7. Этот экспериментальный масштаб требуется субдискретизации экспериментального контроля, как жертвуя одинаковых образцов для каждой временной точки создает неуправляемый экспериментальную установку.
Возможность увеличить количество независимых экспериментов, а с помощью того же суточный пространство инкубатора путем миниатюризации экспериментальную объем для водорослей экспериментов физиологии будет уменьшить или устранить ограничения подвыборки и псевдо-репликации из больших объемов. Формат микропланшетный была разработана для водорослей биопробы с использованием объема культуры в 1 мл для экспериментально манипулируя водорослей в различных условиях. Этот небольшой экспериментальный объем позволяет количество повторов должно быть увеличено, повышает экспериментальную воспроизводимость из-за уменьшения изменчивости между повторными образцов иэксперименты, и позволяет вести репликацию при сохранении экспериментальные элементы управления (то есть, аксенными культур водорослей) для 140 дней (рисунок 2) 12.
Этот формат микротитрационного планшета легко адаптирован для различных экспериментальных вопросов, таких как: браузер бактерии имеют симбиотические, нейтральную или патогенного взаимодействия с его водорослей хоста? Это добавление соединение, стимулирующее или токсичных для водоросли? Эти и другие вопросы могут быть решены в быстром высокой пропускной способом, используя этот новый формат 9-11.
Микропланшетном культура пластина 48 также позволяет каждому 1 мл хорошо, чтобы быть независимым экспериментальная установка, что выборка в одном временной точке. Различные параметры можно попробовать из этого объема 1 мл, включая, но не ограничиваясь ими: флуоресценции хлорофилла и фотохимических параметров с использованием воды, импульсно-модулированные по амплитуде (водно-PAM) флуорометрию (см Материалы и таблицу оборудования) 13. ВОДА-PAM флюометрия является быстрым и неинвазивным методом, который может быть использован для контроля экспериментов, выполненных с водорослей 13. Это позволяет проводить измерения продуктивности фотосинтеза и ФС здоровья из небольшого объема культуры (150 – 300 мкл культуры разводили в среде до 2 – объем 4 мл водно-PAM) 14,15. В дополнение к воде-PAM флуорометрии, эта установка может быть использована для измерения различных других параметров, включая, но не ограничиваясь ими: микроскопии для визуализации бактерии, прикрепленные к клеток водорослей и изменений в морфологии клеток водорослей; бактериальная колония блок формирования (КОЕ); и проточной цитометрии для водорослей кровяных клеток и выработки подгруппах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рост водорослей в миниатюрном формате.
Миниатюризация водорослей культур объема культуры в 1 мл в микротитрационного планшета позволяет репликации в эксперименте должна быть увеличена. Важно, чтобы водоросль здоровым в течение эксперимента; выполнить кривую роста (…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (grant 402105), Canadian Foundation for Innovation (grant 129087) and Alberta Education and Training (grant AAETRCP-12-026-SEG) to RJC.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 10 cu. ft. Diurnal Incubator (6012-1) | Caron Corporate | 112310-6012-1-11 | www.caronproducts.com |
| Nunc EasYFlask 25cm2, Vent/Close Cap, 7mL working volume, 200/Cs | Thermo Fisher Scientific | N156340 | www.fishersci.ca |
| Multiwell TC Plates – 48 Well | BD Biosciences Discovery Labware | 353078 | www.bdbiosciences.com |
| P1000 Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F123602 | www.mandel.ca |
| P10mL Gilson The Pipetting Standard—Gilson's Pipetman | Mandel Scientific Company Inc. | GF-F161201 | www.mandel.ca |
| Wide Orifice Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-468 | www.ca.vwr.com |
| Ultrafine Tips nonsterile [100–1250 µL] | VWR International | 89079-470 | www.ca.vwr.com |
| Finntip 10mL [Vol: 1-10mL] | Thermo Fisher Scientific | 9402151 | www.fishersci.ca |
| WATER-Pulse Amplitude Modulation (Water-ED) | Heinz Walz GmbH, Effeltrich, Germany | EDEE0232 | www.walz.com |
| 15 mm diameter quartz glass cuvette (WATER-K) | Caron Corporate | www.caronproducts.com | |
| Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS), Fisher Chemical | Thermo Fisher Scientific | Thermo Fisher Scientific | www.fishersci.ca |
| BD Difco Marine Broth 2216 | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| BD Bacto Agar | BD Biosciences Discovery Labware | BD Biosciences Discovery Labware | www.bdbiosciences.com |
| L1 Medium Kit, 50L | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | NCMA [National Center for Marine Algae and Microbiota | www.ncma.bigelow.org |
References
- Scarratt, M. G., Marchetti, A. Assessing microbial responses to iron enrichment in the Subarctic Northeast Pacific: Do microcosms reproduce the in situ condition?. Deep Sea Res Part II Top. Stud. Oceanogr. 53 (20-22), 2182-2200 (2006).
- Bidle, K. D., Haramaty, L., Barcelos E Ramos, J., Falkowski, P. Viral activation and recruitment of metacaspases in the unicellular coccolithophore, Emiliania huxleyi. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104 (14), 6049-6054 (2007).
- Moore, L. R., Goericke, R., Chisholm, S. W. Comparative physiology of Synechococcus and Prochlorococcus: influence of light and temperature on growth, pigments, fluorescence and absorptive. Mar. Ecol. Prog. Ser. 116, (1995).
- Iglesias-Rodriguez, M. D., Halloran, P. R. Phytoplankton calcification in a high-CO2 world. Science. 320 (5874), 336-340 (2008).
- Chen, M., Tang, H., Ma, H., Holland, T. C., Ng, K. Y. S., Salley, S. O. Effect of nutrients on growth and lipid accumulation in the green algae Dunaliella tertiolecta. Bioresour. Technol. 102 (2), 1649-1655 (2011).
- Lv, J. -. M., Cheng, L. -. H., Xu, X. -. H., Zhang, L., Chen, H. -. L. Enhanced lipid production of Chlorella vulgaris by adjustment of cultivation conditions. Bioresour. Technol. 101 (17), 6797-6804 (2010).
- Geider, R., Graziano, L., McKay, R. M. Responses of the photosynthetic apparatus of Dunaliella tertiolecta (Chlorophyceae) to nitrogen and phosphorus limitation. Eur. J. Phycol. 33 (4), 315-332 (1998).
- MacIntyre, H. L., Cullen, J. J. Using Cultures to Investigate the Physiological Ecology of Microalgae. Algal Cult. Tech. , 287-326 (2005).
- Blaise, C., Vasseur, P. Algal microplate toxicity test. Small-scale Freshw. Toxic. Investig. Vol. 1 Toxic. Test Methods. , 137-179 (2005).
- Skjelbred, B., Edvardsen, B., Andersen, T. A high-throughput method for measuring growth and loss rates in microalgal cultures. J. Appl. Phycol. 24, 1589-1599 (2012).
- Nagai, T., Taya, K., Annoh, H., Ishihara, S. Application of a fluorometric microplate algal toxicity assay for riverine periphytic algal species. Ecotoxicol. Environ. Saf. 94, 37-44 (2013).
- Seyedsayamdost, M. R., Case, R. J., Kolter, R., Clardy, J. The Jekyll-and-Hyde chemistry of Phaeobacter gallaeciensis. Nat. Chem. 3 (4), 331-335 (2011).
- Schreiber, U., Schliwa, U., Bilger, W. Continuous recording of photochemical and non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching with a new type of modulation fluorometer. Photosynth. Res. 10 (1-2), 51-62 (1986).
- Jones, R. J., Ward, S., Amri, A. Y., Hoegh-Guldber, O. Changes in quantum efficiency of photosystem II of symbiotic dinoflagellates of corals after heat stress, and of bleached corals sampled after the 1998 Great Barrier Reef mass bleaching event. Mar. Freshw. Res. 51 (345), 659-668 (1998).
- Beer, S., Larsson, C., Poryan, O., Axelsson, L. Photosynthetic rates of Ulva (Chlorophyta) measured by pulse amplitude modulated fluorometry. Eur. J. Phycol. 35 (1), 69-74 (2000).
- . . WATER-PAM Chlorophyll Fluorometer. Instrument Description and Information for Users. , (2013).
- Maxwell, K., Johnson, G. M., Heers, J. Chlorophyll fluorescence–a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Herigstad, B., Hamilton, M., Heersink, J. How to optimize the drop plate method for enumerating bacteria. J. Microbiol. Methods. 44 (2), 121-129 (2001).
- Kooten, O., Snel, J. The use of chlorophyll fluorescence nomenclature in plant stress physiology. Photosynth. Res. 25 (3), 147-150 (1990).
- Maxwell, K., Johnson, G. N. Chlorophyll fluorescence–a practical guide. J. Exp. Bot. 51 (345), 659-668 (2000).
- Schreiber, U. Pulse-Amplitude-Modulation (PAM) Fluorometry and Saturation Pulse Method: An Overview. Chlorophyll a Fluoresc. A Signat. Photosynth. , 279-319 (2004).
- Roháček, K., Barták, M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications. Photosynthetica. 37 (3), 339-363 (1999).
- Da Silva, J. M., da Silva, A. B., Pádua, M. Modulated chlorophyll a fluorescence: a tool for teaching photosynthesis. J. Biol. Educ. 41 (4), 178-183 (2007).
- Vieira, S., Ribeiro, L., Jesus, B., Cartaxana, P., da Silva, J. M. Photosynthesis assessment in microphytobenthos using conventional and imaging pulse amplitude modulation fluorometry. Photochem. Photobiol. 89 (1), 97-102 (2013).
