Investigando individual molécula de adhesión por espectroscopia de fuerza atómica
Summary
A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.
Abstract
Espectroscopia de fuerza atómica es una herramienta ideal para estudiar moléculas en superficies e interfaces. Se presenta un protocolo experimental para acoplar una gran variedad de moléculas individuales de forma covalente a una punta de AFM. Al mismo tiempo la punta del AFM se pasiva para evitar interacciones no específicas entre la punta y el sustrato, que es un requisito previo para estudiar moléculas individuales unidos a la punta del AFM. Los análisis para determinar la fuerza de adhesión, la longitud de la adhesión, y la energía libre de estas moléculas en superficies sólidas y bio-interfaces son poco presentaron y se proporcionan referencias externas de lectura adicional. Moléculas ejemplo son los politirosina poli (aminoácido), polímero de injerto PI- g -PS y el Papa fosfolípido (1-palmitoil-2-oleoil- sn -glicero-3-fosfoetanolamina). Estas moléculas son desorbidos de diferentes superficies como CH 3 -SAMs, hidrógeno terminado diamante y apoyaron bicapas lipídicas en diversas condiciones de disolvente. Por último, laventajas de la fuerza espectroscópicas única molécula de experimentos se discuten incluyendo medios para decidir si realmente una sola molécula se ha estudiado en el experimento.
Introduction
Durante los últimos 30 años, la microscopía de fuerza atómica (AFM) ha resultado ser una técnica de formación de imágenes valiosa para estudiar biológicos y sintéticos 1,2 3 materiales y superficies, ya que proporciona una resolución espacial molecular en las tres dimensiones y puede ser operado en varios disolvente ambientes. Además, AFM-fuerza única molécula de espectroscopia (SMF) permite medir las fuerzas que van desde la pN a μN régimen y ha dado una visión sin precedentes, por ejemplo, en el plegamiento de proteínas 4,5, física de polímeros 6-8, y la interacción molécula-superficie solo 9 – 12 .La razón detrás de estudio de las moléculas individuales en lugar de un conjunto de moléculas es evitar los efectos que a menudo enmascaran eventos raros o estados moleculares promedio ocultos. Además, una multitud de parámetros moleculares, tales como la longitud de contorno, la longitud Kuhn, la energía libre de adherencia, etc. puede serobtenido. Esto se detalla en los ejemplos siguientes. En un experimento típico de AFM-SMFS, la molécula de sonda se acopla a una punta muy afilada a través de una molécula de engarce. La punta en sí está situado en el extremo de un voladizo flexible. Si la punta se pone en contacto con la superficie de la molécula de sonda va a interactuar con esta superficie. Mediante la observación de la deflexión del voladizo después de la retracción de la punta, la fuerza, y por lo tanto la energía libre, para separar la molécula de la superficie puede ser determinada. Para obtener estadísticas significativas, un gran número de las llamadas curvas de fuerza-distancia tienes que estar adquirida. Además, para tener una verdadera experimentos sola molécula (es decir, utilizando una y la misma molécula de sonda sobre la duración de todo el experimento) la molécula sonda debe estar acoplado de forma covalente a la punta del AFM. Aquí, se presenta un protocolo experimental para funcionalización en voladizo con una sola molécula a través de un enlace covalente. La molécula sola o bien se puede acoplar a través de un amino o un tiol grupo a la punta del AFM. El proceso de conjugación se puede realizar en una amplia variedad de disolventes (orgánica y acuosa) para tener en cuenta las propiedades de solvatación de los polímeros utilizados.
En la primera parte, un protocolo general para unir covalentemente una molécula única ("molécula de sonda") a través de una molécula de unión a una punta de AFM se describe. Para este fin, NHS orgánico o maleimida-química se utiliza 13. Junto con el protocolo de tres moléculas ejemplo, los procesos de adquisición de datos y análisis de datos se describen y se proporcionan referencias para lectura adicional. Los ejemplos de moléculas son: la (lineal) tirosina polímero, el polímero de injerto PI- g-PS y el Papa de los lípidos. Esto incluye ligeras variaciones del protocolo, por ejemplo para unir covalentemente cisteínas. Además, una sección está dedicada a la preparación de diferentes superficies tales como una superficie de diamante, un CH 3 monocapa -placas, montado y bicapas lipídicas. Estas interfaces tienen proven ser buenas referencias y ejemplos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante las últimas décadas, los experimentos de una sola molécula han proporcionado información sin precedentes sobre los mecanismos moleculares y que resultó ser un enfoque muy valiosa en ciencias de la vida y más allá. Para lograr buenas estadísticas y significativas de los experimentos SMFS, idealmente una y la misma molécula se utiliza en todo el curso del experimento. En contraste con los experimentos con conjuntos de moléculas, los experimentos SMFS son capaces de detectar eventos raros y estados molecu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.
Materials
| Materials | |||
| Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution) | Hellma | ||
| RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35 %), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v)) | Sigma | ||
| Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Vectorlabs | ||
| Dry acetone (< 50 ppm H2O) | Sigma | ||
| Dry chloroform (> 99.9 %) | Sigma | ||
| Triethylamine | Sigma | ||
| Ultrapure water | Biochrom, Germany | ||
| Di-sodium tetraborate (> 99.5 %) | Biochrom, Germany | ||
| Boric Acid | Biochrom, Germany | ||
| Monofunctional α-methoxy-ω-NHS PEG, 5kDa, “methyl-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α,ω-bis-NHS PEG, 6 kDa, “NHS-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Heterobifunctional α-maleimidohexanoic- ω-NHS PEG, 5 kDa, “Mal-PEG-NHS” | Rapp, Germany | ||
| Probe molecule (polymer, lipid, etc.) | |||
| Equipment | |||
| Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10 ml), glass petri dishes (500 µl) and glass lids | VWR International GmbH, Germany | ||
| Laboratory oven model UF30 | Memmert, Germany | ||
| Temperature controlled sonicator | VWR International GmbH, Germany | ||
| Plasma system "Femto", 100 W | Diener, Germany | ||
| One separate glass syringe for each organic solvent | VWR International GmbH, Germany | ||
| Vortex mixer | VWR International GmbH, Germany | ||
| Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml) | Eppendorf | ||
| Pipettes: 10-100 µl, 50-200 µl and 100-1000 µl | Eppendorf | ||
| AFM with temperature controlled fluid cell (e.g. MFP-3D with BioHeater) | Asylulm Research, Santa Barbara | ||
| Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, e.g. MLCT) | Bruker AXS, Santa Barbara |
References
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