ניתוח ההשפעות של תאי סטרומה על הגיוס של לויקוציטים מתזרים

Summary

היכולת של האנדותל מודלק לגייס leukocytes מזרימה מוסדרת על ידי תאי סטרומה mesenchymal. אנו מתארים שני מודלים במבחנה בשילוב תאים אנושיים עיקריים שיכול לשמש כדי להעריך גיוס נויטרופילים מזרימה ולבחון את התפקיד שתאי סטרומה mesenchymal לשחק בויסות התהליך הזה.

Abstract

תאי סטרומה להסדיר את הגיוס במחזור leukocytes במהלך דלקת דרך הצטלבות עם תאי האנדותל שכנים. כאן אנו מתארים שני מודלים במבחנה "כלי דם" ללימוד הגיוס של מחזורי נויטרופילים מזרימה על ידי תאי האנדותל מודלקים. יתרון עיקרי של מודלים אלה הוא היכולת לנתח כל צעד במפל ההידבקות לויקוציטים במטרה, כפי שהיה קורה בvivo. אנו גם מתארים כיצד ניתן להתאים את שני המודלים כדי ללמוד את התפקיד של תאי סטרומה, בתאי גזע mesenchymal זה מקרה (MSC), בויסות גיוס לויקוציטים.

תאי האנדותל עיקריים היו בתרבית לבד או יחד עם MSC אדם במגע ישיר על microslides Ibidi או בצדדים מנוגדים של מסנן Transwell למשך 24 שעות. תרבויות היו מגורה עם אלפא גורם נמק גידול (TNFα) למשך 4 שעות ושולבו assay הידבקות מבוסס זרימה. בולוס של נויטרופילים היה perfusedעל האנדותל למשך 4 דקות. לכידתו של זורם נויטרופילים ויחסי הגומלין שלהם עם האנדותל הייתה דמיינה ידי מיקרוסקופ שלב ניגודיות.

בשני המודלים, ציטוקינים גירוי מוגבר גיוס האנדותל של נויטרופילים זורמים באופן תלוי מינון. ניתוח של ההתנהגות של נויטרופילים גויסו הראה ירידה תלויה-מינון בגלגול ועלייה תלוי-מינון בגלגול דרך האנדותל. בשיתוף התרבות, MSC מודחק הידבקות נויטרופילים להאנדותל מגורה TNFα.

המודלים המבוססת על הידבקות הזרימה שלנו לחקות את השלבים הראשונים של גיוס לויקוציטים מהמחזור. בנוסף לויקוציטים, הם יכולים לשמש כדי לבחון את הגיוס של סוגי תאים אחרים, כגון תאים סרטניים MSC או מחזור מנוהלים טיפולי. דגמי שיתוף התרבות רב-שכבתי שלנו הראו כי MSC לתקשר עם האנדותל לשנות את תגובתם לציטוקינים פרו-דלקתיים, altering הגיוס של נויטרופילים. מחקר נוסף תוך שימוש במודלים אלה נדרש כדי להבין איך תאי סטרומה מרקמות שונות ותנאים (מחלות דלקתיות או סרטן) להשפיע על הגיוס של לויקוציטים במהלך דלקת.

Introduction

דלקת היא תגובה הגנתית לזיהום חיידקים או פגיעה ברקמות שדורשת רגולציה הדוקה של כניסה לויקוציטים וליציאה מהרקמה הדלקתית לאפשר ^1,2 רזולוציה. צלב-שיחה בין תאי האנדותל (EC) שכלי דם קו, כדוריות דם לבנות במחזור ותאי סטרומה רקמות תושב חיונית לתיאום תהליך זה ^3. עם זאת, גיוס בלתי מבוקר של כדוריות דם לבנות והפינוי יעיל שלהם לחזק את התפתחותן של מחלות דלקתיות כרוניות ^4. ההבנה הנוכחית שלנו של גיוס לויקוציטים בבריאות ובמחלה אינה שלמה ויש צורך במודלים חזקים יותר כדי לנתח את התהליך הזה.

המנגנונים התומכים בגיוס של לויקוציטים מהדם דרך כלי דם בEC venules פוסט-נימים תוארו גם ^1,2,5. כדוריות דם לבנות במחזור נלכדים על ידי קולטנים מיוחדים (למשל, VCAM-1, E-selectin, P-selectin) שהם מוסדרים על האנדותל מודלק. אינטראקציות חולפות אלה מאפשרים לויקוציטים לאינטראקציה עם כמוקינים משטח מחויב ומתווכים הנגזרים שומנים (או אנדותל או סטרומה במקור) המפעילים integrins לידי ביטוי על ידי כדוריות דם לבנות ^{6 11.} זה בתורו מייצב הגירת הידבקות וכוננים על פני האנדותל ולתוך הרקמה ^{12 15.} בתוך רקמה, גויס לויקוציטים נתונים לסוכנים הנגזר סטרומה המשפיעים על תנועתיות, תפקוד והישרדות ^16,17. ראיות הולכות ומצטברים מצביעות בבירור על אותות המתקבלים בכל שלב של לויקוציטים תנאי תהליך הגיוס למשנו. עם זאת, ההבנה של גיוס לויקוציטים שלנו נשארת שלמה ומעט מאוד ידוע על תנועת ויקוציטים עיצוב רכיבים בתוך רקמה.

בברמינגהם פיתחנו כמה מודלים "כלי דם" מבחנה ללמוד הגיוס של לויקוציטים מלזרום ^9,18,19. עכשיו אנו מבינים כי רגולטורים מיידיים כמעשה EC כלי דם של גיוס לויקוציטים בתגובה לשינויים במייקרו-הסביבה המקומית שלהם. באופן ספציפי, תאי סטרומה רקמה-תושב יכולים להסדיר באופן פעיל את התגובה הדלקתית, בחלקו על ידי שיחה עם EC כלי הדם השכן להשפיע תפקידם בגיוס ^3. הראינו בעבר כי תאי סטרומה שונים לווסת את היכולת של EC לתמוך הידבקות והגירה של לויקוציטים באופן רקמות ספציפיות, וכי ההשפעות אלה הופכים שינו במחלות כרוניות ^13,16,20,21. כך, תאי סטרומה להקים רקמה 'כתובת קודים "המגדירים את ההקשר של כל תגובה דלקתית ^22. לאחרונה, יש לנו הפגנו שMSC מח עצם נגזר (BMMSC) מטה-להסדיר בעצמת התגובה של EC לציטוקינים, שהביא לירידה בגיוס של שני נויטרופילים וימפוציטים ^23.

מנגנוני גובגיוס erning הובהר במבחנה השתמש בעיקר מבחני שילוב סוג תא בודד (למשל, EC) או חלבון בבידוד. עם זאת, מחקרים אלה לא לוקחים בחשבון את ההשפעות של סביבת הרקמות המקומית (כלומר, הנוכחות של תאי סטרומה) ​​על גיוס של לויקוציטים וההגירה הבאה שלהם לתוך הרקמה. כאן אנו מתארים שתי שיטות המבוססת על זרימה שבו תאי סטרומה, במיוחד mesenchymal תאי גזע (MSC), הם שיתוף תרבותי עם EC ^23. מודלים כאלה מאפשרים לנו לבחון את ההשפעה של תא סטרומה על תגובות אנדותל, ביכולת שלהם בפרט לתמוך גיוס לויקוציטים מזרימה.

Protocol

1. בידוד והתרבות של תאי האנדותל האדם יסודיים ותאי גזע mesenchymal תאי בידוד והתרבות של אדם טבור אנדותל הווריד (HUVEC): שים חבל טבור על מגש עם נייר סופג ולרסס עם אתנול 70%. מניחים בב?…

Representative Results

בתחילה, נתחנו את ההשפעה של גירוי EC עם TNFα על הגיוס של נויטרופילים מזרימה באמצעות מודל Ibidi microslide (סעיף 7 – 9). בהעדר TNFα, מעט אם בכלל נויטרופילים דבקו monolayer האנדותל (איור 2 א). זה היה צפוי, שכלא טופל / המנוחה EC אינו מבטא את המולקולות הדרושות הידבקות (selectins) או כ…

Discussion

כאן אנו מתארים שני מודלים במבחנה "כלי דם" ללימוד הגיוס של מחזורי נויטרופילים ידי האנדותל מודלק. יתרון עיקרי של מודלים אלה הוא היכולת לנתח כל צעד במפל ההידבקות לויקוציטים במטרה, כפי שהיה קורה בvivo. יש לנו שנצפה קודם לכן עלייה תלויה-מינון בהידבקות נויטרופ?…

Materials

Collagenase Type Ia	Sigma	C2674	Dilute in 10ml PBS to get a final concentration of 10mg/ml. Store at -20°C in 1ml aliquots.
Dulbecco's PBS	Sigma	D8662	With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at room temperature.
1X Medium M199	Gibco	31150-022	Warm in 37 °C water bath before use.
Gentamicin sulphate	Sigma	G1397	Store at 4°C. Add to M199 500ml bottle.
Human epidermal growth factor	Sigma	E9644	Store at -20°C in 10µl aliquots.
Fetal calf serum (FCS)	Sigma	F9665	FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56°C. Store in 10ml aliquots at -20°C.
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20°C in 1ml aliquots.
Hydrocortisone	Sigma	H0135	Stock is in ethanol. Store at -20°C in 10µl aliquots.
Collagenase Type II	Sigma	C6885	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100mg/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots.
Hyaluronidase	Sigma	H3631	Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000U/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots.
100µm cell strainer for 50ml centifuge tube	Scientific Lab Supplies (SLS)	352360	Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
DMEM low glucose	Biosera	LM-D1102/500	Warm in 37 °C water bath before use.
Penicillin/Streptomycin mix	Sigma	P4333	Store at -20°C in 1ml aliquots.
25cm2 tissue culture flask	SLS	353109
75cm2 tissue culture flask	SLS	353136
Bone marrow mesenchymal stem cells vial	Lonza	PT-2501	Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
EDTA (0.02%) solution	Sigma	E8008	Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use.
Trypsin solution	Sigma	T4424	Store at -20°C in 2ml aliquots. Thaw at room temperature and use immediately.
Cryovials	Greiner bio-one	2019-02	Keep on ice before adding before adding cell suspension.
Mr. Frosty Freezing Container	Nalgene	5100-0001	Store at room temperature. When adding cryovials with cells store at -80°C for 24h before transfrring cells to liquid nitrogen.
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile	Ibidi	IB-80606	Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cell tracker green dye	Life technologies	C2925	Store in 5µl aliquots at -20°C. Dilute in 5ml prewarmed (at 37°C) MSCGM.
Cell counting chambers	Nexcelom	SD-100	Alternatively a haemocytometer can be used.
Cellometer auto T4 cell counter	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Tumor necrosis factor α (TNFα)	R&D Systems	210-TA-100	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000U/ml. Store at -80°C in 10µl aliquots.
6-well, 0.4µm PET Transwell filters	SLS	353090
K2-EDTA in 10ml tubes	Sarstedt		Store at room temperature.
Histopaque 1119	Sigma	11191	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
Histopaque 1077	Sigma	10771	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
10ml round bottomed tube	Appleton Woods	SC211 142 AS
7.5% BSA Fraction V solution	Life technologies	15260-037	Store at 4°C.
20ml Plastipak syringes	BD falcon	300613
5ml Plastipak syringes	BD falcon	302187
2ml Plastipak syringes	BD falcon	300185
3M hypo-allergenic surgical tape 9m x 2.5cm	Micropore	1530-1	Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3mm (thin tubing)	Fisher Scientific	FB68854	Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4mm (thick tubing)	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line Manometer tubing	Smiths	200/495/200	Tubing leading to the syringe pump.
3-way stopcock	BOC Ohmeda AB
Glass 50ml syringe for pump	Popper Micromate	550962	Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
Glass coverslip	Raymond A Lamb		26x76mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
Parafilm gasket	American National Can Company		Cut a 26x76mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20x4mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133µm.
Two perspex parallel plates	Wolfson Applied Technology Laboratory		Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
Electronic 3-way microvalve with min. dead space	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000)	Harvard Apparatus	70-2001	Set the diameter to 29mm and refill (flow) rate.
L-shaped connector	Labhut	LE876	To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
Video camera	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
			Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.