Analyse der Auswirkungen von Stromazellen an der Rekrutierung von Leukozyten von Flow

Summary

Die Fähigkeit von entzündetem Endothel Leukozyten aus Strömungs Rekrutierung von mesenchymalen Stromazellen geregelt. Wir beschreiben zwei in vitro Modelle mit primären humanen Zellen, die verwendet werden können, um neutrophilen Rekrutierung von Flow zu bewerten und zu prüfen, welche Rolle die mesenchymalen Stromazellen bei der Regulierung dieses Prozesses spielen.

Abstract

Stromazellen wird über die Einstellung der zirkulierenden Leukozyten bei Entzündungen durch Übersprechen mit benachbarten Endothelzellen. Hier beschreiben wir zwei in vitro "vaskuläre" Modelle für die Untersuchung der Rekrutierung von zirkulierenden Neutrophilen von Flow von entzündeten Endothelzellen. Ein wesentlicher Vorteil dieser Modelle ist die Fähigkeit, jeden Schritt in der Leukozytenadhäsion Kaskade zu analysieren, wie es in vivo auftreten. Wir beschreiben auch, wie die beiden Modelle angepasst werden, um die Rolle von Stromazellen, in diesem Fall von mesenchymalen Stammzellen (MSC) zu untersuchen, bei der Regulierung der Leukozytenrekrutierung werden.

Primäre Endothelzellen wurden allein oder zusammen mit menschlicher MSC in direktem Kontakt auf Ibidi Mikroglaschen oder auf gegenüberliegenden Seiten eines Transwell-Filter für 24 h kultiviert. Die Kulturen wurden mit den Tumornekrosefaktor alpha (TNF & agr;) für 4 Stunden stimuliert und in eine flussbasierte Adhäsionsassay eingebaut. Bolus von Neutrophilen perfundiertüber das Endothel für 4 min. Die Erfassung des fließenden Neutrophilen und ihre Wechselwirkungen mit dem Endothel wurde durch Phasenkontrastmikroskopie visualisiert.

In beiden Modellen erhöhte Zytokin-Stimulation endothelialer Rekrutierung von Neutrophilen fließt in einer Dosis-abhängige Weise. Analyse des Verhaltens der rekrutierten Neutrophile zeigten eine dosisabhängige Abnahme der Walzen und eine Dosis-abhängige Zunahme der Transmigration durch das Endothel. Bei Co-Kultur, unterdrückt MSC neutrophile Adhäsion an TNF-stimulierte Endothelzellen.

Unsere flussbasierten Haftmodelle imitieren die ersten Phasen der Rekrutierung von Leukozyten aus dem Kreislauf. Neben Leukozyten, können sie verwendet werden, um die Einstellung von anderen Zelltypen, wie beispielsweise therapeutisch verabreicht MSC oder zirkulierenden Tumorzellen zu untersuchen. Unsere mehrschichtigen Co-Kulturmodelle haben gezeigt, dass MSC kommunizieren Endothel ihre Reaktion auf proinflammatorische Cytokine modifizieren altering die Rekrutierung von Neutrophilen. Weitere Untersuchungen mit Hilfe solcher Modelle ist erforderlich, um zu verstehen, wie Stromazellen aus verschiedenen Geweben und Bedingungen (entzündliche Erkrankungen oder Krebs) Einfluss auf die Rekrutierung von Leukozyten während der Entzündung.

Introduction

Die Entzündung ist eine schützende Immunantwort gegen mikrobielle Infektionen oder Gewebeverletzung, die strenge Regulierung von Leukozyten-Eingangs- und Ausgangs aus dem entzündeten Gewebe benötigt, um die Auflösung ^1,2 erlauben. Übersprechen zwischen Endothelzellen (EC), dass Leitungsblutgefäße, zirkulierenden Leukozyten und gewebe Wohnsitz Stromazellen ist für die Koordinierung dieses Prozesses ^3. , Unkontrollierte Rekrutierung von Leukozyten und deren unwirksam Freiheit zu untermauern jedoch die Entwicklung von chronischen Entzündungskrankheiten ^4. Unser gegenwärtiges Verständnis der Rekrutierung von Leukozyten in Gesundheit und Krankheit ist unvollständig und robustere Modelle sind erforderlich, um diesen Prozess zu untersuchen.

Die Mechanismen, die die Unterstützung der Rekrutierung von Leukozyten aus Blut durch Gefäß EG in post Venolen sind gut beschrieben ^1,2,5 worden. Zirkulierende Leukozyten werden von spezialisierten Rezeptoren (zB VCAM-1, E-Selektin, P-Selektin) erfasst dieauf entzündete Endothel hochreguliert. Diese transienten Interaktionen ermöglichen Leukozyten mit Oberfläche gebunden Chemokinen und Lipid abgeleiteten Mediatoren (entweder endothelialen oder Stroma Ursprungs), die Integrine durch Leukozyten ^{6- 11} ausgedrückt aktivieren interagieren. Dies wiederum stabilisiert die Haftung und Antriebe Migration über das Endothelium in das Gewebe ^{12 bis 15.} Im Gewebe rekrutiert Leukozyten zu Stroma stammenden Mittel, die ihre Beweglichkeit, Funktion und das Überleben ^16,17 beeinflussen unterzogen. Immer deutlicher, deutet stark darauf hin, dass die Signale in jeder Phase der Rekrutierung von Leukozyten Bedingungen für die nächste erhalten. Jedoch bleibt das Verständnis der Leukozytenrekrutierung unvollständig und sehr wenig über die Komponenten Formgebungs Leukozytenbewegung im Gewebe bekannt.

In Birmingham haben wir mehrere in vitro "vaskuläre" Modelle entwickelt, um die Rekrutierung von Leukozyten aus studierenfließen ^9,18,19. Wir verstehen jetzt, dass Gefäß EG fungieren als unmittelbare Regulatoren der Rekrutierung von Leukozyten reagieren auf Veränderungen in ihrer lokalen Mikroumgebung. Insbesondere können gewebe Wohnsitz Stromazellen aktiv reguliert die Entzündungsreaktion, teilweise im Gespräch mit benachbarten Gefäß EG, ihre Rolle bei der Einstellung ³ beeinflussen. Wir haben zuvor gezeigt, dass verschiedene Stromazellen modulieren die Fähigkeit von EG-Adhäsion und Migration von Leukozyten in einer gewebespezifischen Art und Weise zu unterstützen, und dass diese Effekte sich veränderten chronischer Erkrankungen ^13,16,20,21. So Stromazellen etablieren Gewebe "Adresse-Codes", die den Kontext der einzelnen Entzündungsreaktion ²² zu definieren. In letzter Zeit haben wir gezeigt, dass aus dem Knochenmark MSC (BMMSC) potent herunterregulieren die Reaktion der EG auf Zytokine, was zu einer Verringerung in der Rekrutierung von Neutrophilen und Lymphozyten beiden ^23.

Die Mechanismen govErning Rekrutierung aufgeklärt in vitro-Assays wurden weitgehend verwendet, das eine Zelltyp (zB EG) oder Protein isoliert. Allerdings sind diese Studien nicht berücksichtigt die Auswirkungen der lokalen Gewebeumgebung (dh die Anwesenheit von Stromazellen) auf Rekrutierung von Leukozyten und deren anschließende Migration in das Gewebe. Hier beschreiben wir zwei flussbasierte Verfahren, bei denen Stromazellen, insbesondere mesenchymale Stammzellen (MSC), co-kultiviert, das mit EC ^23. Solche Modelle ermöglichen es uns, die Wirkung von Stromazellen auf endothelialen Reaktionen, insbesondere ihre Fähigkeit zur Rekrutierung von Leukozyten aus Fluss unterstützen zu untersuchen.

Protocol

1. Isolierung und Kultivierung von primären humanen Endothelzellen und mesenchymalen Stammzellen Isolierung und Kultur von humanen Nabelschnurvenen-Endothelzellen (HUVEC): Setzen Nabelschnur auf einem Tablett mit Papiertüchern und Spray mit 70% Ethanol. Platzieren Sie in einer Gewebekultur Kapuze. Identifizieren Sie die Vene und kanülieren an beiden Enden. Legen Sie einen Kabelbinder um die Kanüle eingeführt Ende zu sichern. Waschen Sie die venöse Blut mit PBS mit einer Spritze. Füll…

Representative Results

Zunächst untersuchten wir den Effekt der Stimulierung mit TNF EG über die Rekrutierung von Neutrophilen aus Fluss mit dem Ibidi Mikroobjektmodell (Abschnitt 7-9). In Abwesenheit von TNF & alpha;, wenig oder gar keine Neutrophilen an der endothelialen Monoschicht anhaftet (2A). Dies war zu erwarten, da nicht behandelte / Ruhe EG nicht über die erforderliche Adhäsionsmoleküle (Selektine) oder Chemokine Ausdruck zu unterstützen verbindlich 25,26. Im Gegensatz dazu deut…

Discussion

Hier beschreiben wir zwei in vitro "vaskuläre" Modelle für die Untersuchung der Rekrutierung von zirkulierenden Neutrophilen durch entzündete Endothel. Ein wesentlicher Vorteil dieser Modelle ist die Fähigkeit, jeden Schritt in der Leukozytenadhäsion Kaskade zu analysieren, wie es in vivo auftreten. Wir haben bereits festgestellt, eine Dosis-abhängige Zunahme der Neutrophilen-Adhäsion an und Transmigration durch TNF-stimulierte EC ^9,29. Wir beschreiben auch, wie die beiden M…

Materials

Collagenase Type Ia	Sigma	C2674	Dilute in 10ml PBS to get a final concentration of 10mg/ml. Store at -20°C in 1ml aliquots.
Dulbecco's PBS	Sigma	D8662	With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at room temperature.
1X Medium M199	Gibco	31150-022	Warm in 37 °C water bath before use.
Gentamicin sulphate	Sigma	G1397	Store at 4°C. Add to M199 500ml bottle.
Human epidermal growth factor	Sigma	E9644	Store at -20°C in 10µl aliquots.
Fetal calf serum (FCS)	Sigma	F9665	FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56°C. Store in 10ml aliquots at -20°C.
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20°C in 1ml aliquots.
Hydrocortisone	Sigma	H0135	Stock is in ethanol. Store at -20°C in 10µl aliquots.
Collagenase Type II	Sigma	C6885	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100mg/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots.
Hyaluronidase	Sigma	H3631	Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000U/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots.
100µm cell strainer for 50ml centifuge tube	Scientific Lab Supplies (SLS)	352360	Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used.
DMEM low glucose	Biosera	LM-D1102/500	Warm in 37 °C water bath before use.
Penicillin/Streptomycin mix	Sigma	P4333	Store at -20°C in 1ml aliquots.
25cm2 tissue culture flask	SLS	353109
75cm2 tissue culture flask	SLS	353136
Bone marrow mesenchymal stem cells vial	Lonza	PT-2501	Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use.
Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM)	Lonza	PT-3001	Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS.
EDTA (0.02%) solution	Sigma	E8008	Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use.
Trypsin solution	Sigma	T4424	Store at -20°C in 2ml aliquots. Thaw at room temperature and use immediately.
Cryovials	Greiner bio-one	2019-02	Keep on ice before adding before adding cell suspension.
Mr. Frosty Freezing Container	Nalgene	5100-0001	Store at room temperature. When adding cryovials with cells store at -80°C for 24h before transfrring cells to liquid nitrogen.
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile	Ibidi	IB-80606	Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html).
Cell tracker green dye	Life technologies	C2925	Store in 5µl aliquots at -20°C. Dilute in 5ml prewarmed (at 37°C) MSCGM.
Cell counting chambers	Nexcelom	SD-100	Alternatively a haemocytometer can be used.
Cellometer auto T4 cell counter	Nexcelom	Auto T4-203-0238
Tumor necrosis factor α (TNFα)	R&D Systems	210-TA-100	Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000U/ml. Store at -80°C in 10µl aliquots.
6-well, 0.4µm PET Transwell filters	SLS	353090
K2-EDTA in 10ml tubes	Sarstedt		Store at room temperature.
Histopaque 1119	Sigma	11191	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
Histopaque 1077	Sigma	10771	Store at 4°C. Warm to room temperature before use.
10ml round bottomed tube	Appleton Woods	SC211 142 AS
7.5% BSA Fraction V solution	Life technologies	15260-037	Store at 4°C.
20ml Plastipak syringes	BD falcon	300613
5ml Plastipak syringes	BD falcon	302187
2ml Plastipak syringes	BD falcon	300185
3M hypo-allergenic surgical tape 9m x 2.5cm	Micropore	1530-1	Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber.
Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3mm (thin tubing)	Fisher Scientific	FB68854	Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin.
Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4mm (thick tubing)	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line Manometer tubing	Smiths	200/495/200	Tubing leading to the syringe pump.
3-way stopcock	BOC Ohmeda AB
Glass 50ml syringe for pump	Popper Micromate	550962	Must be primed prior to use by removing any air bubbles.
Glass coverslip	Raymond A Lamb		26x76mm coverslips made to order. Lot number 2440980.
Parafilm gasket	American National Can Company		Cut a 26x76mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20x4mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133µm.
Two perspex parallel plates	Wolfson Applied Technology Laboratory		Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel.
Electronic 3-way microvalve with min. dead space	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	Electronically connected to a 12 volt DC power supply.
Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000)	Harvard Apparatus	70-2001	Set the diameter to 29mm and refill (flow) rate.
L-shaped connector	Labhut	LE876	To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel.
Video camera	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded.
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities.
			Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here.