Muligheten av betent endotel å rekruttere leukocytter fra strømning reguleres av mesenchymale stromale celler. Vi beskriver to in vitro-modeller som har primære humane celler som kan brukes til å vurdere neutrofil rekruttering fra strømningen og undersøke rollen som mesenchymale stromale celler spiller i å regulere denne prosessen.
Stromalceller regulere rekrutteringen av sirkulerende leukocytter under betennelse gjennom krysstale med nabo endotelceller. Her beskriver vi to in vitro "vaskulære" modeller for å studere rekruttering av sirkulerende nøytrofile granulocytter fra flyten av betente endotelceller. En stor fordel ved disse modellene er evnen til å analysere hvert trinn i leukocyttadhesjon kaskade i rekkefølge, som ville forekomme in vivo. Vi beskriver også hvordan begge modellene kan tilpasses for å studere rollen til stromale celler, i dette tilfellet mesenchymale stamceller (MSC), i regulering av leukocytt-rekruttering.
Primære endotelceller ble dyrket alene eller sammen med human MSC i direkte kontakt på Ibidi microslides eller på motsatte sider av en Transwell filter i 24 timer. Kulturene ble stimulert med tumornekrosefaktor alfa (TNFa) i 4 timer og innlemmet i en strømningsbasert adhesjonsanalysen. En bolus av nøytrofile ble perfusertover endotelet i 4 min. Fangst av rennende nøytrofile og deres samspill med endotelet ble visualisert ved fasekontrastmikroskopi.
I begge modellene, økt cytokin-stimulering endothelial rekruttering av strømmer nøytrofile på en doseavhengig måte. Analyse av oppførselen til rekrutteres neutrofiler viste en doseavhengig reduksjon i rullende og en doseavhengig økning i transmigrasjon gjennom endotelet. I co-kultur, MSC trykt nøytrofiladhesjon til TNFa-stimulert endotelet.
Våre flytbasert-vedheft modeller ligne de innledende fasene av leukocytt rekruttering fra sirkulasjonen. I tillegg til leukocytter, kan de anvendes til å undersøke rekrutteringen av andre celletyper, slik som terapeutisk administrerte MSC eller sirkulerende tumorceller. Våre flerlags co-kultur modeller har vist at MSC kommunisere med endotelet til å endre sin respons på proinflammatoriske cytokiner, altering rekruttering av nøytrofile. Videre forskning ved hjelp av slike modeller er nødvendig for å fullt ut forstå hvordan stromale celler fra ulike vev og betingelsene (inflammatoriske lidelser eller kreft) påvirker rekruttering av leukocytter ved betennelse.
Betennelse er en beskyttende respons på mikrobiell infeksjon eller vevsskade som krever tett regulering av leukocytt-inngang og utgang fra det betente vevet for å tillate oppløsning 1,2. Krysstale mellom endotelceller (EC) at linjen blodkar, utegående leukocytter og vev-bosatt stromalceller er viktig for å koordinere denne prosessen tre. Men ukontrollert rekruttering av leukocytter og deres ineffektive klaring ligger til grunn for utvikling av kroniske betennelsessykdommer 4. Vår nåværende forståelse av leukocytt rekruttering i helse og sykdom er ufullstendig og mer robuste modeller for å analysere denne prosessen.
Mekanismene som støtter rekruttering av leukocytter fra blod gjennom vaskulær EC i post-kapillære venuler har blitt godt beskrevet 1,2,5. Sirkulerende leukocytter fanges opp av spesialiserte reseptorer (f.eks VCAM-1, E-selectin, P-selektinantistoffer) somer oppregulert på betent endotelet. Disse forbigående interaksjoner tillate leukocytter å samhandle med overflate bundet kjemokiner og lipid-avledet formidlere (enten endotelceller eller stromal opprinnelse) som aktiverer inte uttrykt av leukocytter 6- 11. Dette i sin tur stabiliserer adhesjon og migrasjon stasjoner over endotelet og inn i vevet 12- 15. Innenfor vev, leukocytter rekrutteres utsettes for stromal-avledet midler som påvirker deres motilitet, funksjon og overlevelse 16,17. Økende bevis tyder på at signalene som mottas på hvert trinn i rekrutteringsprosessen vilkår leukocytter for den neste. Men vår forståelse av leukocytt rekruttering er fortsatt ufullstendig og svært lite er kjent om komponentene forme leukocytt bevegelse innenfor vev.
I Birmingham har vi utviklet flere in vitro "vaskulære" modeller for å studere rekruttering av leukocytter fraflyte 9,18,19. Nå forstår vi at vaskulær EC fungere som umiddelbare regulatorer av leukocytt rekruttering ta hensyn til endringer i deres lokale mikromiljøet. Nærmere bestemt, kan vev-resident stromalceller aktivt regulere betennelsesreaksjon, blant annet ved samtale med nabo vaskulær EC til å påvirke sin rolle i rekruttering tre. Vi har tidligere vist at forskjellige stromale celler modulerer evnen av EC å støtte adhesjon og migrasjon av leukocytter i en vev-spesifikk måte, og at disse virkninger blir endret i kroniske sykdommer 13,16,20,21. Dermed stromalceller etablere vev 'adresse-koder' som definerer konteksten av hver betennelsesreaksjon 22. Mer nylig, har vi vist at benmargs avledet MSC (BMMSC) potent nedregulerer responsen av EC til cytokiner, fører til en reduksjon i rekruttering av både neutrofiler og lymfocytter 23.
Mekanismene governing rekruttering belyst in vitro har i stor grad brukes analyser innlemme et enkelt celletype (f.eks EF) eller protein i isolasjon. Men disse studier ikke ta hensyn til virkningene av lokale vev miljø (dvs. tilstedeværelse av stromale celler) på rekrutteringen av leukocytter og deres påfølgende migrasjon inn i vevet. Her beskriver vi to strømningsbaserte metoder hvor stromalceller, spesielt mesenchymale stamceller (MSC), er co-kultivert med EC 23. Slike modeller tillate oss å undersøke effekten av stromal celle på endotelceller svar, spesielt deres evne til å støtte leukocytt rekruttering fra flyt.
Her beskriver vi to in vitro "vaskulære" modeller for å studere rekruttering av sirkulerende nøytrofile ved betent endotelet. En stor fordel ved disse modellene er evnen til å analysere hvert trinn i leukocyttadhesjon kaskade i rekkefølge, som ville forekomme in vivo. Vi har tidligere observert en doseavhengig økning i nøytrofil adhesjon til og transmigrasjon gjennom TNFa-stimulerte EC 9,29. Vi beskriver også hvordan begge modellene kan tilpasses for å studere effektene av…
The authors have nothing to disclose.
Umbilical cords were collected with the assistance of the Birmingham Women’s Health Care NHS Trust. HMM was supported by an Arthritis Research UK Career Development Fellowship (19899) and Systems Science for Health, University of Birmingham (5212).
Collagenase Type Ia | Sigma | C2674 | Dilute in 10ml PBS to get a final concentration of 10mg/ml. Store at -20°C in 1ml aliquots. |
Dulbecco's PBS | Sigma | D8662 | With calcium and magnesium chloride. Keep sterile and store at room temperature. |
1X Medium M199 | Gibco | 31150-022 | Warm in 37 °C water bath before use. |
Gentamicin sulphate | Sigma | G1397 | Store at 4°C. Add to M199 500ml bottle. |
Human epidermal growth factor | Sigma | E9644 | Store at -20°C in 10µl aliquots. |
Fetal calf serum (FCS) | Sigma | F9665 | FCS must be batch tested to ensure the growth and viability of isolated EC. Heat inactivate at 56°C. Store in 10ml aliquots at -20°C. |
Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Potent and becomes toxic within a week so fresh complete HUVEC medium must be made up every week. Store at -20°C in 1ml aliquots. |
Hydrocortisone | Sigma | H0135 | Stock is in ethanol. Store at -20°C in 10µl aliquots. |
Collagenase Type II | Sigma | C6885 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100mg/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots. |
Hyaluronidase | Sigma | H3631 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 20,000U/ml. Store at -20°C in 100µl aliquots. |
100µm cell strainer for 50ml centifuge tube | Scientific Lab Supplies (SLS) | 352360 | Other commercially available cell strainers (e.g. Greiner bio-one) can also be used. |
DMEM low glucose | Biosera | LM-D1102/500 | Warm in 37 °C water bath before use. |
Penicillin/Streptomycin mix | Sigma | P4333 | Store at -20°C in 1ml aliquots. |
25cm2 tissue culture flask | SLS | 353109 | |
75cm2 tissue culture flask | SLS | 353136 | |
Bone marrow mesenchymal stem cells vial | Lonza | PT-2501 | Store in liquid nitrogen upon arrival. Cells are at passage 2 upon arrival but are designated passage 0. Exapand to passage 3 and store in liquid nitrogen for later use. |
Mesenchymal stem cell growth medium (MSCGM) | Lonza | PT-3001 | Warm in 37 °C water bath before use. For Cell Tracker Green staining use medium without FCS. |
EDTA (0.02%) solution | Sigma | E8008 | Store at 4°C. Warm in 37°C water bath before use. |
Trypsin solution | Sigma | T4424 | Store at -20°C in 2ml aliquots. Thaw at room temperature and use immediately. |
Cryovials | Greiner bio-one | 2019-02 | Keep on ice before adding before adding cell suspension. |
Mr. Frosty Freezing Container | Nalgene | 5100-0001 | Store at room temperature. When adding cryovials with cells store at -80°C for 24h before transfrring cells to liquid nitrogen. |
Ibidi u-Slide VI (0.4), T/C treated, sterile | Ibidi | IB-80606 | Alternative models include glass capillaries, Cellix Biochips (www.cellixltd.com), BioFlux Plates (www.fluxionbio.com/bioflux/) and GlycoTech parallel plate flow chambers (http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html). |
Cell tracker green dye | Life technologies | C2925 | Store in 5µl aliquots at -20°C. Dilute in 5ml prewarmed (at 37°C) MSCGM. |
Cell counting chambers | Nexcelom | SD-100 | Alternatively a haemocytometer can be used. |
Cellometer auto T4 cell counter | Nexcelom | Auto T4-203-0238 | |
Tumor necrosis factor α (TNFα) | R&D Systems | 210-TA-100 | Dilute stock in PBS to a final concentration of 100,000U/ml. Store at -80°C in 10µl aliquots. |
6-well, 0.4µm PET Transwell filters | SLS | 353090 | |
K2-EDTA in 10ml tubes | Sarstedt | Store at room temperature. | |
Histopaque 1119 | Sigma | 11191 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | Store at 4°C. Warm to room temperature before use. |
10ml round bottomed tube | Appleton Woods | SC211 142 AS | |
7.5% BSA Fraction V solution | Life technologies | 15260-037 | Store at 4°C. |
20ml Plastipak syringes | BD falcon | 300613 | |
5ml Plastipak syringes | BD falcon | 302187 | |
2ml Plastipak syringes | BD falcon | 300185 | |
3M hypo-allergenic surgical tape 9m x 2.5cm | Micropore | 1530-1 | Use to secure the syringe tap onto the wall of the perspex chamber. |
Silicon rubber tubing, internal diameter/external diameter (ID/OD) of 1/3mm (thin tubing) | Fisher Scientific | FB68854 | Cut silicon tubing to the appropriate size. All tubing leading directly to the electronic microvalve must be thin. |
Silicon rubber tubing ID/OD of 2/4mm (thick tubing) | Fisher Scientific | FB68855 | |
Portex Blue Line Manometer tubing | Smiths | 200/495/200 | Tubing leading to the syringe pump. |
3-way stopcock | BOC Ohmeda AB | ||
Glass 50ml syringe for pump | Popper Micromate | 550962 | Must be primed prior to use by removing any air bubbles. |
Glass coverslip | Raymond A Lamb | 26x76mm coverslips made to order. Lot number 2440980. | |
Parafilm gasket | American National Can Company | Cut a 26x76mm piece of parafilm using an aluminium template and cut a 20x4mm slot into it using a scalpel 10a. Gasket thickness is approximately 133µm. | |
Two perspex parallel plates | Wolfson Applied Technology Laboratory | Specially designed chamber consisting of parallel plates held together by 8 screws. The lower plate has a viewing slot cut out in the middle and a shallow recess milled to allow space for the coverslip, filter and gasket. The upper perspex plate has an inlet and outlet hole positioned over the flow channel. | |
Electronic 3-way microvalve with min. dead space | Lee Products Ltd. | LFYA1226032H | Electronically connected to a 12 volt DC power supply. |
Syringe pump for infusion/withdrawal (PHD2000) | Harvard Apparatus | 70-2001 | Set the diameter to 29mm and refill (flow) rate. |
L-shaped connector | Labhut | LE876 | To attach to the inlet and outlet ports onto the Ibidi microslide channel. |
Video camera | Qimaging | 01-QIC-F-M-12-C | Connected to a computer which enables digitall videos to be recorded. |
Image-Pro Plus 7.0 | Media Cybernetics | 41N70000-61592 | For data analysis. Manually tag cells displaying the different behaviors. Track cells for analysis of rolling and migration velocities. |
Refer to product datasheets for details on hazards of using the reagents described here. |