Sumoylation과 신진 효모 동원체 단백질 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지 할 수 있습니다 단백질 정제 기술
Summary
이 원고는 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비지에, sumoylation 및 동원체 단백질, Ndc10 및 Ndc80의 유비퀴틴의 검출에 대해 설명합니다.
Abstract
이러한 인산화, 메틸화, 아세틸 화, 유비퀴틴 및 sumoylation 같은 번역 후 변형 (PTMS)는, 많은 단백질의 세포 기능을 조절한다. 센트로 DNA와 연관 동원체 단백질의 PTMS는 유전체의 안정성을 유지하기 위해 충실한 염색체 분리를 중재. 같은 질량 분석 및 웨스턴 블롯 분석과 같은 생화학 적 접근 방법이 가장 일반적으로 PTMS의 식별을 위해 사용된다. 여기서, 단백질의 정제 방법은, 사카로 마이 세스 세레 비지에 동원체 단백질 Ndc10 및 Ndc80의 sumoylation 및 유비퀴틴 양쪽의 검출을 허용하는 기술된다. Ndc10 Myc와 – 태그 또는 Ndc80가 건설하고 우리의 연구에 사용 된 표현 폴리 히스티딘 플래그 태그가 Smt3 (HF-Smt3) 및 변형. sumoylation의 검출을 위해, 우리는 니켈 비드를 사용하여 자신 태깅 sumoylated 단백질을 정제 친화력 프로토콜을 고안 sumoylated Ndc10 A를 검출하기 위해 항 – 나 Myc 항체로 웨스턴 블롯 분석을 이용ND Ndc80. 유비퀴틴의 검출을 위해, 우리는 Myc와 태그가 단백질의 면역을위한 프로토콜을 고안 Ndc10과 Ndc80이가 도처 것을 보여 방지 UB 항체와 웨스턴 블롯 분석을 사용했다. 우리의 결과는 그의 플래그에 대한 관심의 에피토프 태그 단백질이 Smt3 변형 여러 PTMS의 검출을 용이하게 태그를 보여줍니다. 앞으로의 연구는이 기술의 개발은 특정 PTM에 의존 단백질 상호 작용을 식별하고 특성화 할 수 있도록해야한다.
Introduction
각각 표적 단백질에 (S. cerevisiae의 1 Smt3 SUMO) 유비퀴틴과 sumoylation는 유비퀴틴과 작은 유비퀴틴 같은 수정의 활용을 할 수 있습니다. 동원체 단백질 PTMS 충실한 염색체 분리를 보장하기 위해 상이한 세포주기 단계에서 자신의 세포 수준 및 단백질 – 단백질 상호 작용에 영향을 미친다. 예를 들어, Cse4 / CENP-A 및 외부 동원체 단백질 Dsn1의 세포 수준 게놈 안정성 2-5을 보장하기위한 유비퀴틴 매개 단백질 분해에 의해 조절된다. 잘못된 동원체 – 미세 소관 첨부 불안정 직접 미세 소관 6-8과 상호 작용 Dam1과 Ndc80 단지를 인산화 Ipl1 / 오로라 B 키나제가 필요합니다. 일흔을 통해 동원체 단백질의 확인에도 불구하고, PTMS, 예를 들어, 유비퀴틴과 SUMO 이러한 단백질의 변형을 조사 거의 연구가있다. 주요한 제한은 PTM을 보존하는 능력이다정화 및 sumoylation, 인산화, 메틸화, 등과 같은 PTMS의 검출을위한 사용자 정의 항체의 소수 중의. sumoylated 동원체 단백질의 특성은 Ndc10, Cep3는 Bir1 및 Ndc80 사용자 정의 항체 (9)를 이용했다. 또한 Ndc10 유비퀴틴은 10 기재로서 연루되어왔다. 인간 Hec1 (S. cerevisiae의에서 Ndc80)도 APC / C-hCdh1 E3 리가 아제 (11)에 의해 규제, 유비퀴틴 화를 위해 기판이다. 따라서, Ndc10 및 Ndc80는 S.에서 sumoylation 및 유비퀴틴을 모두 감지 할 수있는 프로토콜의 최적화를위한 좋은 후보입니다 cerevisiae의.
sumoylation의 식별을 용이하게하기 위해, 우리는 HF-Smt3 및 Myc와 태그가 Ndc10 또는 Ndc80을 표현 균주를 건설했다. 에피토프 태그 (HF :을 His6-FLAG)의 사용으로 인해 자주 후보 단백질에 대해 발생하는 폴리 클로 날 혈청에서 관찰되고 교차 반응의 배경을 최소화한다. 우리는 선호도와 프로토콜을 고안HF-Smt3 접합체를 정제 한 다음 정제 Smt3 제제 sumolyated Ndc10 및 Ndc80의 존재를 검출하기 위해 상업적 방지 플래그 및 안티 나 Myc 항체를 사용 하였다. 유비퀴틴을 위해, 우리는 Myc와 태그가 동원체 단백질의 유비퀴틴 화를 보존하는 변형 된 면역 프로토콜을 고안 Ndc10과 Ndc80의 유비퀴틴 화를 감지하는 상업 항 UB 항체로 웨스턴 블롯 분석을 수행 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이러한 HA, Myc와, 플래그 및 GST와 같은 에피토프 태그 널리 단백질의 생화학 적 분석을 위해 사용된다. HF-Smt3 및 Ndc10 Ndc80과 같은 나 Myc 태그가 동원체 단백질과 균주의 구성은 이러한 sumoylation 유비퀴틴과 같은 PTMS의 검출을 용이하게한다. HF-Smt3 분석를 풀다운는 sumoylated 동원체 단백질, Ndc10 및 Ndc80 (그림 1)의 검출을 할 수 있습니다. 안티 – 플래그 항체를 이용하여 친 화성 정화 프로토?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.
Materials
| Glass beads | BioSpec Products | 11079105 | 0.5 mm dia. |
| Mini beadbeater | BioSpec Products | #693 | 8 cell disrupter |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | 100 ml |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8215 | 1 ml |
| Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | A7470 | 1 ml |
| Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | Primary antibody, dilution 1:1000 |
| c-Myc antibody (A-14) | Santa Cruz Biotechnology | sc-789 | Primary antibody, dilution 1:5000 |
| Purified mouse antibody monoclonal 9E10 | Covance | MMS-150P | Primary antibody, dilution 1:5000 |
| Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody | Covance | MMS-258R | Primary antibody, dilution 1:1000 |
| ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Nitrocellulose membrane | Novex | LC2001 | 0.45 mm pore size |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Novex | NP0321BOX | 1.0 mm, 10 well |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Novex | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Transfer Buffer | Novex | NP0006-1 | 20x |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34078 | |
| 10x PBS pH7.4 | GIBCO | 70011-044 | |
| Blue sensitive X-Ray film | Dbio | DBOF30003 | |
| Automatic developer | Kodak | M35AX-OMAT | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | 50 mg |
| MG-132 | Selleck Chemicals | S2619 | 25 mg |
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