Белок Очистка Техника, что позволяет выявлять и SUMOylation Убиквитинирование бутонизации дрожжей кинетохор белков Ndc10 и Ndc80
Summary
Эта рукопись описывает обнаружение SUMOylation и убиквитинирование кинетохорных белков, Ndc10 и Ndc80, в многообещающий дрожжей Saccharomyces CEREVISIAE.
Abstract
Посттрансляционных модификаций (PTMs), такие как фосфорилирование, метилирование, ацетилирование, убиквитинирования и SUMOylation, регулируют клеточную функцию многих белков. PTMs из кинетохорных белков, которые связывают с центромерной ДНК посредником верный сегрегации хромосом для поддержания стабильности генома. Биохимические подходы, такие как масс-спектрометрии и западной блот-анализа наиболее часто используется для идентификации PTMs. Здесь способ очистки белка описано, что позволяет обнаруживать как SUMOylation и убиквитинирования из кинетохорных белков, Ndc10 и Ndc80, в Saccharomyces CEREVISIAE. Штамм, который выражает полигистидином Флаг-тегами Smt3 (ВЧ-Smt3) и Мус-меченый Ndc10 или Ndc80 был построен и используется для наших исследований. Для обнаружения SUMOylation, мы разработали протокол аффинной очистки His-меткой sumoylated белки с помощью никелевых шарики и используется Вестерн-блоттинга с анти-Myc антитела для выявления sumoylated Ndc10 Aй Ndc80. Для обнаружения убиквитинирования, мы разработали протокол для иммунопреципитации Мус-меченных белков и используется Вестерн-блоттинга с анти-Ub антитела, чтобы показать, что Ndc10 и Ndc80 которые убиквитинируется. Наши результаты показывают, что эпитоп тегами интерес белок в Его-Flag помечены штамм Smt3 облегчает обнаружение нескольких PTMs. Будущие исследования должны позволить эксплуатации этой техники, чтобы определить и охарактеризовать белковые взаимодействия, которые зависят от конкретного ПТМ.
Introduction
Убиквитинирование и сумоилирования позволяют сопряжение убиквитином и Малый Убиквитин-как модификатора (SUMO; Smt3 в S.cerevisiae, 1) к белку-мишени, соответственно. PTMs из кинетохорных белков влияют на их клеточном уровнях и белок-белковых взаимодействий на различных этапах клеточного цикла, чтобы обеспечить точное сегрегации хромосом. Например, сотовые уровни Cse4 / CENP-A и внешний белка кинетохор Dsn1 регулируются убиквитин-опосредованной протеолиза для обеспечения стабильности генома 2-5. Дестабилизация неправильных кинетохорных микротрубочек вложений требует B киназы Ipl1 / Aurora, который фосфорилирует Dam1 и Ndc80 комплексы, которые непосредственно взаимодействуют с микротрубочками 6-8. Несмотря на выявление более семидесяти кинетохорных белков, существует очень мало исследований, которые исследуют изменения этих белков с PTMs, например, убиквитином и сумо. Основным ограничением является способность сохранять PTMс во время очистки и нехваткой таможенных антител для обнаружения PTMs, таких как SUMOylation, фосфорилирования, метилирования, и другие. Характеристика sumoylated кинетохорных белков Ndc10, Cep3, Bir1 и Ndc80 используется пользовательский антитела 9. Кроме того, Ndc10 был вовлечен в качестве субстрата для убиквитинирования 10. Человек Hec1 (Ndc80 в S.cerevisiae,) также субстратом для убиквитинирования, регулируется APC / C-hCdh1 E3 лигазы 11. Таким образом, Ndc10 и Ndc80 являются хорошими кандидатами для оптимизации протокола для выявления как SUMOylation и убиквитинирование в S. Cerevisiae.
Для облегчения идентификации SUMOylation, мы построили штаммов, которые выражают HF-Smt3 и Мус-меченый Ndc10 или Ndc80. Использование эпитопные метки (HF: His6-Flag) сводит к минимуму фон из-за перекрестной реактивности, что часто наблюдается в поликлональной сывороткой, выработанном против белок-кандидат. Мы разработали протокол к близостиочистить ВЧ-Smt3 конъюгатов, а затем использовали коммерческий анти-Flag и анти-Myc антитела для обнаружения присутствия sumolyated Ndc10 и Ndc80 в очищенный препарат Smt3. Для убиквитинирования, мы разработали модифицированный протокол иммунопреципитации, который сохраняет убиквитинирование из Мус-меченых белков кинетохорных и осуществляется вестерн-блот анализ с коммерческой анти-Ub антитела для выявления убиквитинирование Ndc10 и Ndc80.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эпитоп теги, такие как HA, Мус, флаг, и GST широко используются для биохимического анализа белков. Строительство штаммов с HF-Smt3 и Мус-меченных кинетохорных белков, таких как Ndc10 и Ndc80, облегчает обнаружение PTMs таких как SUMOylation и убиквитинирования. ВЧ-Smt3 снести анализа позволяет выявлять sumoylate…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Oliver Kerscher for support and advice and members of the Basrai laboratory for their support and comments on the paper. This work was supported by the National Institutes of Health Intramural Research Program.
Materials
| Glass beads | BioSpec Products | 11079105 | 0.5 mm dia. |
| Mini beadbeater | BioSpec Products | #693 | 8 cell disrupter |
| Ni-NTA superflow | Qiagen | 30430 | 100 ml |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8215 | 1 ml |
| Anti-c-Myc agarose affinity gel antbody produced in rabbit | Sigma-Aldrich | A7470 | 1 ml |
| Monoclonal anti-Flag M2 antibody produced in mouse | Sigma-Aldrich | F1804 | Primary antibody, dilution 1:1000 |
| c-Myc antibody (A-14) | Santa Cruz Biotechnology | sc-789 | Primary antibody, dilution 1:5000 |
| Purified mouse antibody monoclonal 9E10 | Covance | MMS-150P | Primary antibody, dilution 1:5000 |
| Ubiquitin (P4G7) monoclonal antibody | Covance | MMS-258R | Primary antibody, dilution 1:1000 |
| ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
| ECL Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Secondary antibody, dilution 1:5000 |
| DC protein assay | Bio-Rad | 500-0116 | |
| Nitrocellulose membrane | Novex | LC2001 | 0.45 mm pore size |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | Novex | NP0321BOX | 1.0 mm, 10 well |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer | Novex | NP0002 | 20x |
| NuPAGE Transfer Buffer | Novex | NP0006-1 | 20x |
| SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate | Thermo Scientific | 34078 | |
| 10x PBS pH7.4 | GIBCO | 70011-044 | |
| Blue sensitive X-Ray film | Dbio | DBOF30003 | |
| Automatic developer | Kodak | M35AX-OMAT | |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | M1404 | 50 mg |
| MG-132 | Selleck Chemicals | S2619 | 25 mg |
References
- Johnson, P. R., Hochstrasser, M. SUMO-1: Ubiquitin gains weight. Trends Cell Biol. 7, 408-413 (1997).
- Hewawasam, G., et al. Psh1 is an E3 ubiquitin ligase that targets the centromeric histone variant Cse4. Mol Cell. 40, 444-454 (2010).
- Ranjitkar, P., et al. An E3 ubiquitin ligase prevents ectopic localization of the centromeric histone H3 variant via the centromere targeting domain. Mol Cell. 40, 455-464 (2010).
- Au, W. C., et al. A novel role of the N terminus of budding yeast histone H3 variant Cse4 in ubiquitin-mediated proteolysis. 유전학. 194, 513-518 (2013).
- Akiyoshi, B., et al. The Mub1/Ubr2 ubiquitin ligase complex regulates the conserved Dsn1 kinetochore protein. PLoS Genet. 9, e1003216 (2013).
- Biggins, S., et al. The conserved protein kinase Ipl1 regulates microtubule binding to kinetochores in budding yeast. Genes Dev. 13, 532-544 (1999).
- Cheeseman, I. M., et al. Phospho-regulation of kinetochore-microtubule attachments by the Aurora kinase Ipl1p. Cell. 111, 163-172 (2002).
- Liu, D., Lampson, M. A. Regulation of kinetochore-microtubule attachments by Aurora B kinase. Biochem Soc Trans. 37, 976-980 (2009).
- Montpetit, B., Hazbun, T. R., Fields, S., Hieter, P. Sumoylation of the budding yeast kinetochore protein Ndc10 is required for Ndc10 spindle localization and regulation of anaphase spindle elongation. J Cell Biol. 174, 653-663 (2006).
- Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Mol Biol Cell. 22, 4726-4739 (2011).
- Li, L., et al. Anaphase-promoting complex/cyclosome controls HEC1 stability. Cell Prolif. 44, 1-9 (2011).
- Takahashi, Y., Yong-Gonzalez, V., Kikuchi, Y., Strunnikov, A. SIZ1/SIZ2 control of chromosome transmission fidelity is mediated by the sumoylation of topoisomerase II. 유전학. 172, 783-794 (2006).
- Liu, C., Apodaca, J., Davis, L. E., Rao, H. Proteasome inhibition in wild-type yeast Saccharomyces cerevisiae cells. Biotechniques. 42, 158 (2007).
- Kitamura, E., Tanaka, K., Kitamura, Y., Tanaka, T. U. Kinetochore microtubule interaction during S phase in Saccharomyces cerevisiae. Genes Dev. 21, 3319-3330 (2007).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Kinetochore assembly: if you build it, they will come. Curr Opin Cell Biol. 23, 102-108 (2011).
