Method Article

배아 마우스의 뇌에 추적 조건부 유전 Transsynaptic

DOI:

10.3791/52487

⸱

December 22nd, 2014

 , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Saarland School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이진 유전 전략을 활용하여 Cre 매개 재조합 후 상보적 시냅스 경진 추적자를 발현하는 마우스의 신경 회로 추적을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 세포 특이적 추적자 생산은 유전적으로 암호화되기 때문에 당사의 실험적 접근 방식은 단일 세포 해상도에서 쥐 배아 뇌 발달 중 신경 회로의 형성 및 성숙을 연구하는 데 적합합니다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

해부학적 경로 추적은 뇌와 행동 사이의 관계를 해독하는 데 매우 중요합니다. 그러나 뇌의 배아 성숙 과정에서 신경 회로의 형성을 밝히는 것은 기술적으로 어려운 일인데, 현재까지 개발된 대부분의 시냅스 경유 추적 방법은 입체택시 추적자 주입에 의존하기 때문입니다. 이 문제를 극복하기 위해 우리는 쥐의 뇌에서 조건부 유전자 시냅스 경단 추적을 위한 이진 유전 전략을 개발했습니다. 이를 위해 Cre 매개 재조합 후 ROSA26 유전자 자리에서 양방향 시냅스 경호 추적자 보리 렉틴(BL)과 역행 시냅스 경진 추적자 테파누스 독소 단편 C를 선택적으로 발현하기 위해 두 개의 상보적인 knock-in 마우스 균주를 생성했습니다. 이 마우스의 세포 특이적 추적자 생산은 유전적으로 암호화되어 있으며 기계적 추적자 주입에 의존하지 않습니다. 따라서 우리의 실험적 접근 방식은 배아 쥐 뇌의 신경 회로 형성을 연구하는 데 적합합니다. 또한, 시냅스를 가로지르는 추적자 전달은 시냅스 활동에 의존하기 때문에 이러한 마우스 균주는 단일 세포 해상도에서 뇌 발달 중 유전적으로 정의된 뉴런 집단 간의 통신을 분석하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 새로운 재조합 ROSA26 대립유전자를 사용하여 마우스 배아에서 시냅스 경유 추적을 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 발달 중인 암컷 쥐 뇌에서 생식 축의 성숙에 기저가 되는 신경 회로를 설명하기 위해 이 실험 기술을 활용했습니다.

Introduction

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해부학 경로 추적은 뇌와 행동 한 관계를 해독하는데 가장 일반적으로 사용되는 도구 중 하나이다. 신경 회로 추적 기술의 발전은 마우스 2 유전자 확인 된 신경 세포 집단에서 신경 회로를 추적 할 수있는 기능 신경 과학자을 수여했다. 이러한 기술적 인 발전에도 불구하고 그것은 특히 배아 성숙 중에 신경 회로의 형성을 해명 도전 남아있다. 현재까지 개발 된 추적 방법 중 대부분 transsynaptic 트레이서 정위 주사 또는 신경성 유전자 변형 바이러스 (도 1) 2,3- 기반으로하기 때문이다. 이러한 기술은 연결 공간 및 시간 해상도, 이러한 현상 뇌, 주사 부위에서 대부분의 impor 주사 부위의 재현성, 잠재적으로 염증 기술적 도전 탐침 주사와 같은 몇몇의 본질적인 한계를 달성하면서신경성 바이러스로 인한 tantly 세포 독성은 4 개 사용을 제한한다.

다른 방법은 유전자 변형 생쥐에서 유전자와 transsynaptic 추적자을 표현하는 것입니다. 우리는 최근에이 기술을 수정 및 유전자 확인 된 신경 세포 인구 5의 신경 회로를 매핑하는 이진 유전 transsynaptic 추적 시스템을 개....

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Protocol

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참고 : 윤리 문 : 동물 과목을 포함하는 절차는 함부르크 대학과 자를란 트 대학의 동물 복지위원회에 의해 승인되었다.

1. 준비 및 배아 조직의 고정

  1. 배아를 해부하고, 동물을 희생하기 전에 조직의 후속 고정을위한 솔루션을 준비하는 데 필요한 모든 장비를 정렬합니다.
    주의 : 항상 (pH 7.4까지 조정을 0.1 M 인산 완충 생리 식염수 (PBS)에 4 % PFA) 신선한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 용액을 제조 하였다.
  2. 윤리적으로 승인 절차 시간이 초과 임신 여성 마우스를 안락사.
  3. 플랫폼에 마우스를 전송합니다. 70 % 에탄올로 복부의 복부 측면을 적시고 복강을 노출 예리한 가위를 사용하여 수직 절개.
  4. 배아 체인을 확인하고 신중하게 사용 무딘 집게를 잡아 당깁니다과 얼음처럼 차가운 PBS에 배치합니다.
  5. 에서 개별 배아를 제거미세 가위와 집게를 사용하여 배아 체인. 배아 주위에 여분의 조직을 제거하고 얼음처럼 차가운 PBS로 씻어.
  6. (PFA로 배아를 전송하기 전에) 작은 꼬리 생검을 가지고 성별 식별 및 추적 대립 유전자의 유전자형 PCR 용 꼬리 용해 버퍼에 품어.
  7. 대부분의 측면에서 배아에....

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Results

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이 섹션에서는 R26-BIZ (B L- I RES-τlac의 Z)과 R26-GTT (G FP-TT C) 대립 유전자와 협력을 얻을 수있다 대표적인 결과를 보여줍니다. 여기에서 우리는 생식 축 조절 신경 회로의 성숙을 분석 R26-BIZ 및 R26-GTT 대립 유전자를 사용합니다. 척추 동물의 복제를 중앙에서 성선 자극 호르몬 방출 호르몬 (GnRH에)을 분비하는 시상 하부의 신경 세포의 작은 부분 집합에 의해 제어된다. Kisspeptin, GnRH에 뉴런의 강력한 활성화 제,의 GnRH 및 kisspeptin 뉴런들 사이의 신경 회로가 5 알려지지 않았다 현상 암컷 마우스 뇌에서 성립하지만 때의 GnRH 뉴런의 활성 조절에 관여한다. 먼저 우리는 BIZ과 GTT 유전자의 발현은 특히 배아에 Cre 호텔 의존 재조합에 의해 활성화되는 것을 보여kisspeptin 특정 Cre 호텔 드라이버 라인 (10)을.......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유 전적으로 정의 뉴런 집단의 신경 회로를 추적 트랜스 transsynaptic 트레이서로 표현하면 트레이서 neurotopic 바이러스 또는 정위 주사에 비해 몇 가지 장점을 가지고있다. 먼저, 추적기 내인성 단백질로서 생산하고, 따라서 임의의 면역 반응을 유도하지 않으며 선택적 신경 통로 재현성을 다른 동물에서 분석 될 수있다. 이 비 침습적 방법이기 때문에 둘째, 자궁 내, 예를 들어, 정위 주사 쉽게 접근하지 뉴런으로부터 회로를 추적하는데 이용 될 수있다. 제한 추적을 검출에 어려움이 발생할 수 있습니다 transsynaptic 전송에 일반적으로 낮은 효능을 포함한다. 또한, 추적 분자는 모든 시냅스에 희석됩니다. 대조적으로, 바이러스 복제 신경성 차례로 바이러스 복제는 시냅스를 횡단 한 후 신호를 증폭 리드. 그러나, 바이러스 복제는 또한 주요이다 limitat극한 인한 바이러스 성 신경성 세포 독성 바이러스의 사용 이온. 유전 transsynaptic 추적자 및 유전자 변형 신경성 바이러스의 일부 기.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

원고에 대한 비판적인 논평을 해준 마이클 캔들리시에게 감사한다. 이 프로젝트는 Deutsche Forschungsgemeinschaft의 보조금 BO1743/6 및 SFB/TRR 152 P11 및 Z02의 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
비스벤즈이미드(Hoechst 33258 염료)Sigma14530-100MG
에탄올Sigma32205-1L
극저온 금형(필어웨이)Polyscience Inc.18646A-122 x 22 x 20mm
DMSO시그마D8418-100ML
디메틸 포름아미드(DMF)VWR 화학 물질23470,293
EGTAROTH3054.3
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
글루타르알데히드 시그마G5882-50ML
과산화수소시그마34988-7
이소펜탄(메틸 2-부탄)시그마M32631-2.5L
카이저의 글리신 젤라틴머크1092420100
메탄올시그마494437-1L
MgCl2SigmaM2670-100G
NaClROTHHN00.2
NBT시그마298-83-9
Nonidet P40 대체Fluka743.85
OCTLeica14020108926
PAP 펜DakoS2002
파라팜알데히드시그마P6148-1KG
나트륨 데옥시콜레이트시그마D6750-25G
자당시그마S7903-1KG
Superfrost 슬라이드Thermo ScientificFT4981GLPLUS
TSA 키트PerkinElmerNEL700
TSA 플러스 키트PerkinElmerNEL749A001KT
TrisROTHAE15.2
Triton-X 100ROTH3051.2
Tween 20ROTH9127.1
X-galROTH2315.1
저온 유지 장치Leicana
광학 현미경, DIC 이미징이 장착된ZeissAxioskop2, Axio Vision 소프트웨어가
Axio Vision 소프트웨어가Zeiss
PhotoshopAdobePS6
Goat anti-WGA(BL 인식)Vector LaboatoriesAS-2024
Biotinylayted horse anti-goat IgGVector LaboatoriesBA-9500
Biotinylated goat anti-rabbit IgGVector LaboatoriesBA-1000
Rabbit anti-GFP (recognizes GTT)InvitrogenA11122
Rabbit anti-GnRHAffinity Bio ReagentPA1-121
Dylight488-donkey anti-rabbit IgGThermo ScientificSA5-10038
SA-Alexa Fluor 546Life TechnologiesS-11225
Primers
BL Fwd (BIZ 유전형 분석용)Eurofins MWG OperonATGAAGATGATGAGCACCAGGGC
BL Rev (BIZ 유전형 분석용)Eurofins MWG OperonAGCCCTCGCCGCAGAACTC
Cre Fwd (Cre 유전형 분석용)Eurofins MWG OperonGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG
Cre Rev (Cre 유전형 분석용)Eurofins MWG OperonCCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC
TTC Fwd (GTT 유전형 분석용)Eurofins MWG OperonAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT
TTC Rev (GTT 유전형 분석용)Eurofins MWG OperonGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA
XY Fwd (성별 유전형 분석)Eurofins MWG OperonTGAAGCTTTTGGCTTTGA
XY Rev (성별 유전형 분석용)Eurofins MWG OperonCCGCTGCCAAATTCTTTG
ROSA26 FwdEurofins MWG OperonCGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
ROSA26 RevEurofins MWG OperonGCAGATGGAGCGGGAGAAAT
SA RevEurofins MWG OperonCGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
품 장착된 Zeiss Axioskop2, 장착된 Axioskop2, , ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
  2. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in t....

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