Рыбок данио кератоцитов Экспланты по изучению коллективной миграции клеток и реэпителизации кожного заживления ран
Summary
Рыбок данио кератоциты мигрировать в клеточных листов из эксплантов и обеспечить модель в пробирке для изучения механизмов коллективного миграции клеток в контексте эпителия заживления ран. Эти протоколы деталь эффективный способ создать первичные культуры эксплантов для использования в коллективных анализов клеточной миграции.
Abstract
Благодаря своим уникальным подвижных свойств, рыба кератоциты в отрыве от эксплантов культуры уже давно используются для изучения механизмов миграции одной клетки. Однако, когда экспланты установлено, эти клетки также перемещаются вместе, сохраняя многие черты, которые делают индивидуальный кератоциты привлекательную модель для изучения миграции: быстрые темпы моторики, обширные актин-богатых ламеллы с перпендикулярной актина кабеля, а также сравнительно постоянной скоростью и Направление миграции. В начале эксплантов, быстрое взаимное превращение клеток, мигрирующих в индивидуальном порядке с тех, кто мигрирует вместе позволяет изучение роли межклеточных спаек в определении режима миграции, и подчеркивает, молекулярные связи между этими двумя режимами миграции. Клетки в более поздних эксплантов теряют способность быстро и коллективно мигрировать в эпителиальных чтобы мезенхимального перехода происходит, и гены, связанные с заживлением ран и воспаления дифференциально экспрессируются, Таким образом, кератоцитов эксплантаты могут служить в качестве модели в пробирке для реэпителизации, что происходит во время заживления ран кожи и может представлять собой уникальную систему для изучения механизмов коллективного миграции клеток в контексте определенной программы изменения экспрессии генов. Разнообразие мутантных и трансгенных линий данио имеются, которая позволяет эксплантов, который будет создан из рыбы с различными генетическими фонов. Это позволяет роль различных белков в этих процессах, чтобы быть однозначно решить. Протоколы, описанные здесь, описывают простой и эффективный способ создания этих эксплантов культур для использования в различных анализах, связанных с коллективной миграции клеток.
Introduction
Исследования клеточной подвижности традиционно сосредоточено на индивидуальном мигрирующих клеток. Кератоциты культивированный из рыбы и амфибии эксплантов оказались мощным модельной системой для изучения механизмов клеточной подвижности с помощью как экспериментальных, так и математическое моделирование подходов 1-6. Экспериментальная работа по отдельности, мигрирующих клеток автоматизированного быстрым, плавным движением скользящей клеток, сохраняя одинаковую форму, скорость и направление. Тем не менее, в живом организме, клетки часто двигаться вместе при поддержании межклеточных соединений, в частности, в процессе эмбриогенеза, заживления ран, и метастазирования. Таким образом, коллектив миграция клеток является растущей и все более важной областью исследований в рамках области миграции клеток. Коллектив миграция этих клеток недавно были описаны 7 и она имеет много уникальных особенностей, которые делают его мощная система для изучения коллективного миграцию клеток в модели заживления раны.
ove_content "> Когда весы сорвал с наркозом взрослых данио, некоторые эпителиальной ткани остается привязанным к нижней части шкалы. Когда среда для культивирования клеток добавляется, эти эпителиальные клетки, или кератиноциты, быстро мигрируют в качестве коллективного устройства от масштаба. Эксплант можно рассматривать как эпителиального заживления ран модели, в которой клетки мигрируют от эксплантов, как они будут по предварительной матрицы раневое ложе, чтобы восстановить интактный эпителий. Последние данные показывают, что этот экс виво культуры имитирует многие особенности в естественных условиях заживление ран у взрослых рыбок данио. Рана скоростью сближения 8 перевести на скорость миграции аналогичной той, что наблюдается в Экс Vivo системы 7. Кроме того, в раны в естественных условиях модели заживления, лечение варфарином позволяет предположить, что гемостаз не влияет на скорость исцеления, в то время как обработка гидрокортизоном для уменьшения иммунный ответ не задерживает реэпителизацию 8 </SUP>. Как данио не кровоточат, когда шкала удаляется из животного, гемостаз не является основным игроком. Хотя мы нашли иммунные клетки в эксплантов, мы не изучали влияние они могут оказать на коллективной миграции клеток.Протокол, представленные здесь описывает, как установить данио культуры кератоцитов эксплантов, обеспечивающие согласованность и воспроизводимость для использования во многих биологических анализов. Эти эксплантов культуры являются особенно очевидной в пробирке модель для коллективного миграции клеток по нескольким причинам. Во-первых, данио кератоциты являются первичные клетки, используемые в течение нескольких часов создания эксплантов культур. Таким образом, эти клетки не претерпели морфологические и генетические изменения выражение, связанное с прохождением первичных клеток 9-13. Во-вторых, эта система представляет собой модель для изучения реэпителизации в ответ на ранение 14, а в рамках ответа на ранения, эпителиальной к мезенхимальных TRansition (EMT) процесс инициируется о чем свидетельствуют изменения в экспрессии генов и цитоскелета перестроек 14,15. Таким образом, фоновые изменения в экспрессии генов и подвижности, которые происходят в необработанных клеток были охарактеризованы и обеспечивают контекст для интерпретации изменения с лечения. Кроме того, рыба кератоцитов и кератиноцитов человека функционально эквивалентны; оба первичные эпителиальные клетки соответствующих видов и играют ключевую роль в заживлении ран эпителия. В-третьих, взрослых данио приобретают все большее признание в качестве модельной системы для различных заболеваний человека 16-18 в том числе меланомы и других раковых заболеваний 19-21, кожные заживления ран 8,14 и регенерации тканей 22-24.
Технические преимущества этой модельной системы одинаково убедительными. Все большее число мутантных и трансгенных линий доступны из некоммерческих, централизованных. В частности, мутации проекта данио рерио (ZMP) В Wellcome Trust Sanger Institute направлена на создание нокаутом аллель в каждом кодирующей белок гена в данио генома. В настоящее время они мутировали 11892 генов, примерно 45% генома, с 24088 аллелей отличающийся. Кроме того, ZMP принимает предложения и будет генерировать нокауты бесплатно. Последние методы генной нокдаун в личиночной и взрослых данио 25-28 обеспечивают гибкость для изучения функции с развитием важных генов, для которых трансгенные подходы проблематично или нецелесообразно.
Из-за их чрезвычайно быстрыми темпами моторики ~ 145 мкм / ч вскоре после создания культур 29, анализы могут быть быстро завершена (как правило, в 24 ч или менее). Как эксперименты могут быть быстро завершена, и культуры хорошо растут при комнатной температуре, несколько технических препятствий, связанных с миграцией клеток млекопитающих, включающие анализы видеомикроскопия избежать. Кроме того, в эпоху ужесточения исследовательские бюджеты, zebrafМОГ легко и недорого поддерживать.
Структура и поведение эксплантов является сложным. Как рыба не кровоточат, когда шкала удаляется, то маловероятно, что намного больше, чем поверхностные слои эпидермиса удаляются с масштабом. Кератиноциты, по всей видимости, является преобладающим типом клеток в эксплантов, когда весы, первоначально удалены из рыбы, подавляющее большинство клеток, по всей видимости пятно с анти-Е-кадгерина антителом 14. Кроме того, нет никаких доказательств того, фибробластов в первичной культуры можно судить по отсутствию окраски виментина с помощью иммунофлуоресценции 14. Тем не менее, с удалением повторном масштаба, как представляется, быть многочисленные нейтрофилы в эксплантата (смотрите видео 1). Мы определили, как эти клетки нейтрофилов на основе морфологических наблюдений от их размера, быстро подвижности, а также их миграции из клетки листа при воздействии на LPS (данные не показаны). Кроме того, эти клетки окрашиваются ярко остроумиеч антитело к нейтрофилов цитозольного фактора, а также с различными вторичными антителами IgG, что указывает, что они имеют обильные FcRs на своей поверхности (данные не показаны). Несколько слоев клеток присутствуют в эксплантов. Конфокальной микроскопии обнаруживается присутствие одного слоя вблизи переднего края до более чем двух слоев кератоцитов возле шкалы с нейтрофилов видимых сверху, снизу, и между клеткой кератоцитов листов.
В начале временных точках, клетки на краю многослойной эксплантов поляризации, инициирующего коллективного миграции кератоцитов из эксплантов на начальных скоростей ~ 145 мкм / ч. Площадь, покрытая эксплантата быстро возрастает, что приводит к ячейке распространения, напряжение в пределах листа, а пониженная скорость продвижения передней кромки. Быстрые взаимные между лидером и последователем клеток наблюдаются на переднем крае в процессе формирования и закрытия спонтанно образующихся отверстий в листе 7. КакEMT процесс, начатый с эксплантата продолжает лист фрагменты и кератиноциты теряют специализированные, быстрый моторику. Экспрессия генов и морфологические изменения, согласующиеся с EMT, заживление ран и воспалительные реакции происходят в течение 7 дней культуры с экспланты рассматривается жизнеспособность в течение примерно 10 дней 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важным шагом для успеха кератоцитов эксплантов культуры позволяет масштаб, чтобы присоединиться к культуральной чашке в течение приблизительно 2 – 3 мин перед добавлением в культуральную среду. Приблизительно 75% весов будет прилипать и расти листов (количество культур, устано…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана за счет средств Среднем Западе Университетского колледжа наук о здоровье Исследования по упрощению гранта, предоставленного для EEH и Среднем Западе университета Управления научных исследований и программ, финансируемых Внутренние гранта, предоставленного для KJL.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) | MatTek | P35GC-1.5-14-C | 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area. |
| Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 | VWR | 21909-460 | We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal. |
References
- Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. Keratocytes generate traction forces in two phases. Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).
- Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453, 475-480 (2008).
- Lacayo, C. I., et al. Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics. PLOS Biology. 5, 233 (2007).
- Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. Principles of locomotion for simple-shaped cells. Nature. 362, 167-171 (1993).
- Kolega, J. The Movement of Cell Clusters. J. Cell Sci. 49, 15-32 (1981).
- Kolega, J. Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture. The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).
- Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes. Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).
- Richardson, R., et al. Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research. Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).
- Cheon, H., et al. Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals. Clinica., & Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).
- Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture. Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).
- Schnaper, H. W., et al. Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells. Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).
- Tondreau, T., et al. In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues. Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).
- Zimmermann, T., et al. Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture – primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells. Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).
- McDonald, T. M., et al. Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., & morphological changes support epithelial–mesenchymal transition. Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).
- Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures. Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).
- Barut, B. A., Zon, L. I. Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease. Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T., Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. . Methods in Cell Biology. 105, 309-337 (2011).
- Li, P., White, R. M., Zon, L. I., Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. . Methods in Cell Biology. 105, 403-417 (2011).
- Yen, J., et al. The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models. Genome Biology. 14, R113 (2013).
- Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration. PLoS One. 4, e5824 (2009).
- Dufourcq, P., Vriz, S. The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration. Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin. Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva. Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).
- Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation. BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).
- Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells. Experimental Cell Research. In press, (2014).
- Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models). The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).
- McDonald, T. M., et al. Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation. Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).
- Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).
- Sire, J. -. Y., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration. The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).
- Xu, Z., et al. Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).
- Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).
- Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture. Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).
- Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis. In Vitro Cellula., & Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).
- Schober, M., et al. Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics. The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).
